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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菜鸟求助：PCR扩增和扩增产物的克隆？？
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cly2810

金虫 (正式写手)

[求助] 菜鸟求助：PCR扩增和扩增产物的克隆？？

书上如是说：在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。

我不明白的地方是，要获得目的DNA片段就是通过PCR。PCR的产物就是DNA片段，要将产物克隆就是要获得更多的片段，继续PCR不就行了么？？

我理解的是PCR的产物中只有两条模板链是长的，其他的都是短的对吗？可以P出与模板链一样长的链吗？？


菜鸟问题，大虾见笑
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1楼2013-07-02 16:55:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 中肯的建议！ 2013-07-03 02:10:23
我觉得你需要补充一下分子生物学基础知识。
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2楼2013-07-03 00:28:19
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-03 02:10:06
cly2810: 金币+1, ★有帮助 2013-07-09 16:43:03
PCR产物克隆，进一步鉴定，比如测序，才知道是否是目的DNA片段,而且，PCR产物有的是有突变的，不一定符合实验需要。
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为什么
3楼2013-07-03 02:02:01
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cly2810

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:28:19
我觉得你需要补充一下分子生物学基础知识。

废话
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4楼2013-07-04 13:54:51
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nxguojunxian

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励新虫交流 2013-07-09 13:06:06
cly2810: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-07-09 16:42:41
关于你的这段话的2个问题：
1 PCR就是对目的DNA的富集过程。如果只想做多态性研究就不必做克隆，但以下情况需要你做克隆：a:要测序的目的片段较短，需要连到载体克隆后测序；b:认为目的基因内存在杂合位点，碱基的缺失和突变等情况；c:下一步试验的需要，比如需要对目的基因进行功能研究 ;
2 既然PCR是目的DNA富集的过程，经过30轮左右的指数定增过程，最终PCR产物中都是您的目的DNA大小的DNA片段。
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5楼2013-07-08 16:24:52
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-09 13:06:15
cly2810: 金币+1, ★有帮助 2013-07-09 16:42:51
"我理解的是PCR的产物中只有两条模板链是长的，其他的都是短的对吗？可以P出与模板链一样长的链吗？？"

除了模板还是原来那么长（排除在反应中被降解的理想情况下），还会以线性增长扩增一头是引物，一头是一直延伸超过目的片段长度的，如果延伸温度足够长，会一直延伸到比较复杂的结构为止，然后是以指数增长扩增的两头是引物的目的产物，估计就是你说的短的产物。
一般的PCR用聚合酶不能进行超长片段扩增，不过，如果模板本身是PCR产物，再次PCR是有可能扩增到模板那么长的，按理论说是完全有可能，但实际试验操作时，还是要进行摸索，主要是PCR产物非特异性扩增的条带以及其他原因抑制扩增，通常需要做不同稀释倍数的摸索。
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为什么
6楼2013-07-09 08:05:23
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cly2810

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nxguojunxian at 2013-07-08 16:24:52
关于你的这段话的2个问题：
1 PCR就是对目的DNA的富集过程。如果只想做多态性研究就不必做克隆，但以下情况需要你做克隆：a:要测序的目的片段较短，需要连到载体克隆后测序；b:认为目的基因内存在杂合位点，碱基的 ...

可不可以这样理解：PCR扩增并不能确保特异性，而经过酶切、连接到载体、克隆等步骤则可以保证目的片段的特异性扩增以及表达？
PCR是一个富集过程，而克隆等则有筛选的作用？
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7楼2013-10-10 16:09:26
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cly2810

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2013-07-09 08:05:23
"我理解的是PCR的产物中只有两条模板链是长的，其他的都是短的对吗？可以P出与模板链一样长的链吗？？"

除了模板还是原来那么长（排除在反应中被降解的理想情况下），还会以线性增长扩增一头是引物，一 ...

可不可以这样理解：PCR扩增并不能确保特异性，而经过酶切、连接到载体、克隆等步骤则可以保证目的片段的特异性扩增以及表达？
PCR是一个富集过程，而克隆等则有筛选的作用？
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8楼2013-10-10 16:10:05
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cly2810

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2013-07-03 02:02:01
PCR产物克隆，进一步鉴定，比如测序，才知道是否是目的DNA片段,而且，PCR产物有的是有突变的，不一定符合实验需要。

可不可以这样理解：PCR扩增并不能确保特异性，而经过酶切、连接到载体、克隆等步骤则可以保证目的片段的特异性扩增以及表达？
PCR是一个富集过程，而克隆等则有筛选的作用？
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9楼2013-10-10 16:10:43
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by cly2810 at 2013-10-10 16:10:43
可不可以这样理解：PCR扩增并不能确保特异性，而经过酶切、连接到载体、克隆等步骤则可以保证目的片段的特异性扩增以及表达？
PCR是一个富集过程，而克隆等则有筛选的作用？...

影响PCR的因素很多，而且扩增的过程有可能会发生突变，而克隆得到的质粒，在大肠杆菌内扩增保真率比PCR更高，质粒复制再提取质粒获得完全相同的片段要比直接PCR来得容易也更有保证。而且PCR会有一定的非特异带非目的带扩增出来，如果得到的片段需要进行克隆进行表达或其他功能研究，就需要在克隆后鉴定是否目的带。
如果只是检测是否有预期的片段，直接PCR就可以了，更常见的是实时定量PCR检测，不用再进行克隆也能达到某些目的，比如mRNA的转录水平等。
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为什么
10楼2013-10-11 18:45:47
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