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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药代动力学 » 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）
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西风瘦

银虫 (小有名气)

[交流] 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）

本人第一次做体外肝微粒体代谢实验，做药物代谢，用LC-MS/MS测，但是具体细节不知从何入手，希望各位高手不吝赐教！
我是从BD直接购买的肝微粒体成品和NADPH还原系统，不知道微粒体到了之后该怎么样保存，如何解冻？操作要在什么样的器皿里进行呢？需要无菌操作或者有什么特殊要求么？反应15min够吗？反应时间是怎么确定的呢？
整个实验过程操作上有没有什么要求，因从来没做过，真是如何下手操作，先谢过各位高手了！
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1楼2012-08-30 15:26:17
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回帖置顶 ( 共有5个 )

西风瘦

银虫 (小有名气)
再问一下，最后我要用LC-MS/MS检测，但是我查到一个方法微粒体储备液用浓缩微粒体，里要加磷酸钾盐缓冲液和EDTA配置，但是不知道储存条件和时间？另外，是为了排除质谱的钠干扰才用钾盐缓冲液而不用常用的钠盐缓冲液吗？可是EDTA也是钠盐啊？
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2楼2012-08-30 15:35:05
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liuzhaomin

金虫 (著名写手)
★ ★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
leecius: 金币+1, 谢谢参与。 2012-08-31 09:23:21
你需要看文献
一般的操作是微粒体蛋白  0.1mg/ml （需优化） tris-盐酸缓冲液
加入反应的药物 如果是做动力学的话  需要不同浓度的药物 DMSO溶解的话 保证终体积小于1% 然后加入NADPH起始 孵育时间 蛋白浓度 需要摸索 要求是代谢产物的生成和孵育时间及蛋白浓度呈线性关系
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4楼2012-08-30 23:52:53
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kkbyb

木虫 (著名写手)
★ ★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
leecius: 金币+1, 谢谢参与。 2012-08-31 09:23:38
不用的酶最好先不要配制成酶缓冲液，就以买来时的原态于-80度保存，不需无菌，但要避免试剂污染，反应时间根据化合物来，有的1个小时也不代谢，有的15分钟已经没有原型了，你做代谢必须要保证残余30%的原型化合物才比较合适，肯定是需要2次了
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5楼2012-08-31 08:58:52
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西风瘦

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuzhaomin at 2012-08-30 23:52:53
你需要看文献
一般的操作是微粒体蛋白  0.1mg/ml （需优化） tris-盐酸缓冲液
加入反应的药物 如果是做动力学的话  需要不同浓度的药物 DMSO溶解的话 保证终体积小于1% 然后加入NADPH起始 孵育时间 蛋白浓度 需要 ...

我后面要用LC-MS/MS检测，我查到好像是不能用tris做缓冲液吧？PBS里有大量的钠盐，是不是也不太合适？用什么比较好呢？
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6楼2012-08-31 10:24:47
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liuzhaomin

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西风瘦 at 2012-08-31 10:24:47
我后面要用LC-MS/MS检测，我查到好像是不能用tris做缓冲液吧？PBS里有大量的钠盐，是不是也不太合适？用什么比较好呢？...

可以用的 最后用等体积的乙腈或者甲醇终止反应  离心 上清中的盐不会太多
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7楼2012-08-31 15:54:04
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一凡依旧

金虫 (小有名气)
★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
楼主，我想问下你买的NADPH还原系统是不是孵育液A和B啊？还有就是想问下怎么使用的，我也要做肝微粒体实验，不知道如何下手啊。
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8楼2012-11-06 10:21:43
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Nancy1988

银虫 (小有名气)
★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
3楼: Originally posted by yingying1588 at 2012-08-30 15:54:07

你们是在哪里买的孵育液呢？可否给个联系方式？
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9楼2012-11-21 23:10:12
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西风瘦

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Nancy1988 at 2012-11-21 23:10:12
你们是在哪里买的孵育液呢？可否给个联系方式？...

我买的ＢＤ公司的
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10楼2012-11-22 18:04:11
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bigpalewolf

金虫 (正式写手)
★ ★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
西风瘦: 金币+1, 非常感谢！！ 2012-11-27 08:46:01
买来的估计是30mg/ml的 管子， 直接冻到-80就可以了， 每次用的时候冰上融化就ok啦， 反复冻融多次也还能用（尽量避免）。
不需要无菌条件， 如果只做I相代谢，一般做1小时就行了，还要找个阳性对照， 如ethoxycoumarin。
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11楼2012-11-27 05:18:03
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whyxmc

新虫 (初入文坛)
★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
同学你好，我也是第一次做肝微粒体实验，有个问题请教，请问你做肝微粒体大概用了多少的原料药啊，我现在要买，但是不知道该买多少mg！
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12楼2013-03-20 17:05:39
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西风瘦

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by whyxmc at 2013-03-20 17:05:39
同学你好，我也是第一次做肝微粒体实验，有个问题请教，请问你做肝微粒体大概用了多少的原料药啊，我现在要买，但是不知道该买多少mg！

这个得根据你的反应体系来看吧，我的整个反应体系只有125uL，所以用的原料药很少。我用的反应浓度是5mg/mL enzyme, 20uM原料药，你可以换算一下。
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13楼2013-03-21 16:22:28
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whyxmc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 西风瘦 at 2013-03-21 16:22:28
这个得根据你的反应体系来看吧，我的整个反应体系只有125uL，所以用的原料药很少。我用的反应浓度是5mg/mL enzyme, 20uM原料药，你可以换算一下。...

哦 知道了 灰常感谢啊
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14楼2013-03-23 08:32:04
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西风瘦

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by whyxmc at 2013-03-23 08:32:04
哦 知道了 灰常感谢啊...

不好意思，那天给你写错了，我买的BD的人肝微粒体，反应中的实际浓度是0.5mg/mL蛋白，不是5
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15楼2013-03-24 09:32:13
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春茧春茧

禁虫 (小有名气)
★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
16楼2014-09-16 23:12:22
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forevernever

木虫 (小有名气)
★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
没做过，同求。。。
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17楼2014-09-17 10:12:20
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923158905

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主UDPGA溶液是怎么配的?请问能配成溶液然后冻起来（不用小的离心管分装），溶解后再使用可以吗？反复冻融对UDPGA有没有影响？
另外，丙甲菌素直接用水溶解可以吗？
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18楼2015-10-17 18:01:50
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梦庆双飞

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuzhaomin at 2012-08-30 23:52:53
你需要看文献
一般的操作是微粒体蛋白  0.1mg/ml （需优化） tris-盐酸缓冲液
加入反应的药物 如果是做动力学的话  需要不同浓度的药物 DMSO溶解的话 保证终体积小于1% 然后加入NADPH起始 孵育时间 蛋白浓度 需要 ...

楼主你好，小妹请教一个问题，细胞培养一般要求DMSO在体系中终浓度不超过0.1%。你刚刚说的DMSO终体积小于1%，请问1%终体积的DMSO会对微粒体产生不良影响吗？由于我的药为总提物，所以特别不好溶解，如果DMSO终体积为1%的话问题就解决了。万分感谢
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19楼2016-03-08 20:35:57
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免为鱼肉

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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20楼2018-09-14 16:38:33
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免为鱼肉

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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21楼2018-09-14 16:47:53
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yingying15883楼
2012-08-30 15:54   回复  
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
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