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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药代动力学 » 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）
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西风瘦

银虫 (小有名气)

[交流] 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）

本人第一次做体外肝微粒体代谢实验，做药物代谢，用LC-MS/MS测，但是具体细节不知从何入手，希望各位高手不吝赐教！
我是从BD直接购买的肝微粒体成品和NADPH还原系统，不知道微粒体到了之后该怎么样保存，如何解冻？操作要在什么样的器皿里进行呢？需要无菌操作或者有什么特殊要求么？反应15min够吗？反应时间是怎么确定的呢？
整个实验过程操作上有没有什么要求，因从来没做过，真是如何下手操作，先谢过各位高手了！
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1楼 2012-08-30 15:26:17
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liuzhaomin

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西风瘦 at 2012-08-31 10:24:47
我后面要用LC-MS/MS检测，我查到好像是不能用tris做缓冲液吧？PBS里有大量的钠盐，是不是也不太合适？用什么比较好呢？...

可以用的 最后用等体积的乙腈或者甲醇终止反应  离心 上清中的盐不会太多
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7楼2012-08-31 15:54:04
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西风瘦

银虫 (小有名气)
再问一下，最后我要用LC-MS/MS检测，但是我查到一个方法微粒体储备液用浓缩微粒体，里要加磷酸钾盐缓冲液和EDTA配置，但是不知道储存条件和时间？另外，是为了排除质谱的钠干扰才用钾盐缓冲液而不用常用的钠盐缓冲液吗？可是EDTA也是钠盐啊？
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2楼2012-08-30 15:35:05
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liuzhaomin

金虫 (著名写手)
★ ★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
leecius: 金币+1, 谢谢参与。 2012-08-31 09:23:21
你需要看文献
一般的操作是微粒体蛋白  0.1mg/ml （需优化） tris-盐酸缓冲液
加入反应的药物 如果是做动力学的话  需要不同浓度的药物 DMSO溶解的话 保证终体积小于1% 然后加入NADPH起始 孵育时间 蛋白浓度 需要摸索 要求是代谢产物的生成和孵育时间及蛋白浓度呈线性关系
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4楼2012-08-30 23:52:53
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kkbyb

木虫 (著名写手)
★ ★
西风瘦(金币+1): 谢谢参与
leecius: 金币+1, 谢谢参与。 2012-08-31 09:23:38
不用的酶最好先不要配制成酶缓冲液，就以买来时的原态于-80度保存，不需无菌，但要避免试剂污染，反应时间根据化合物来，有的1个小时也不代谢，有的15分钟已经没有原型了，你做代谢必须要保证残余30%的原型化合物才比较合适，肯定是需要2次了
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5楼2012-08-31 08:58:52
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