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新手求助~关于克隆的若干问题~ 已有4人参与
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最近克隆一个2300bp左右的片段，用的是p-GEMT载体。总是连接不上，不知道是哪里出了问题~ PCR产物胶回收纯化后~ 连接体系：PCR产物 3 ul buffer 5ul 载体 1ul T4连接酶 1ul 4度过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到50ul感受态冰浴半小时，42.4度热激90s，冰浴3分钟，加LB（不含AMP）400u 37度孵育一小时，， l取80ul涂平板，用了蓝白斑筛选，板长的挺好的 但是挑了24个没有一个连接上的~已经做了几次了 不知道是哪里出了问题。。 另外，想问下载体和产物的比例是什么样比较合适~都是按实验室师兄师姐的体系加的不知道比例这回事，， 新手还望大家多多指教 先谢过了。。。 |
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ltfe567
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4楼2014-07-27 14:42:18
hailey
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【答案】应助回帖
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我也是新手，前段时间刚做了干扰载体的构建，我就实验过程是这样的 连接体系：PCR产物 2ul dd水 5ul 10*T4 ligase buffer 1ul 载体 1ul T4连接酶 1ul 16度pcr仪过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到感受态(10ul：50ul)冰浴半小时，42度热激60s，迅速冰浴2分钟，加LB（不含AMP）400u 37度孵育2h,然后就涂板，结果很好，然后我又做酶切，测序验证，都没有问题。过程就是这样的，我只是把我的实验记录写下来了，你看看吧，希望对你有帮助。 |
2楼2014-07-27 11:02:43
hailey
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