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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因全长克隆
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godloveplum

金虫 (小有名气)

[求助] 基因全长克隆 已有4人参与

我想克隆基因的全长，但是我不知道基因全长的准确序列，只是有通过同源性比较基因组得出的假定的序列，用假定序列设计引物后，没有P出条带来，希望有经验的前辈能给予指点，不胜感激！
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
1楼 2014-07-13 14:38:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

青青草allan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
godloveplum(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:56:50
godloveplum: 金币+3, ★有帮助 2014-08-02 09:15:55
godloveplum: 金币+5, ★有帮助 2014-08-02 09:17:39
先找到和你的实验标本亲缘关系较近的物种中该基因的全长，然后根据该基因全长设计引物，扩增出一个中间片段，然后根据你扩出的中间片段，分别设计3‘和5’RACE引物，用RACE试剂盒扩出3‘和5’端全长，最后拼接在一起得到该基因的全长。
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爱出者爱返，福往者福来
5楼2014-07-15 14:28:30
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普通回帖

冉兆星

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的难道不是模式生物吗？
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2楼2014-07-13 14:52:23
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红尘客栈

木虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币-1, 应助指数-1, 屏蔽内容, 抄袭 2014-07-13 19:21:28
本帖内容被屏蔽
3楼2014-07-13 15:13:03
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冉兆星 at 2014-07-13 14:52:23
你用的难道不是模式生物吗？

不是的
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
4楼2014-07-14 12:15:24
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-07-15 14:28:30
先找到和你的实验标本亲缘关系较近的物种中该基因的全长，然后根据该基因全长设计引物，扩增出一个中间片段，然后根据你扩出的中间片段，分别设计3‘和5’RACE引物，用RACE试剂盒扩出3‘和5’端全长，最后拼接在一起 ...

非常感谢！
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
6楼2014-07-15 15:11:53
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piaoxue1216

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-07-15 14:28:30
先找到和你的实验标本亲缘关系较近的物种中该基因的全长，然后根据该基因全长设计引物，扩增出一个中间片段，然后根据你扩出的中间片段，分别设计3‘和5’RACE引物，用RACE试剂盒扩出3‘和5’端全长，最后拼接在一起 ...

我是把基因的片段都扩出来了，包括中间片段，race5’和race3’，也设了引物，用的模板是测序返回来的质粒，但是就是拼接不上去，想问一下引物有什么要求吗，是片段两两加进去 还是三段片段一起加进去
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7楼2014-07-15 16:43:05
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by godloveplum at 2014-07-15 15:11:53
非常感谢！...

不客气，祝一切顺利！
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爱出者爱返，福往者福来
8楼2014-07-15 21:35:04
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by piaoxue1216 at 2014-07-15 16:43:05
我是把基因的片段都扩出来了，包括中间片段，race5’和race3’，也设了引物，用的模板是测序返回来的质粒，但是就是拼接不上去，想问一下引物有什么要求吗，是片段两两加进去 还是三段片段一起加进去...

5’端和3’端全长都得到了吗？你说拼接不上去，意思是不是得到的各个片段间都没有重叠序列？
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爱出者爱返，福往者福来
9楼2014-07-15 21:38:25
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piaoxue1216

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-07-15 21:38:25
5’端和3’端全长都得到了吗？你说拼接不上去，意思是不是得到的各个片段间都没有重叠序列？...

是的，都得到了，各个片段之间也有重叠的，现在是有一些能拼接上去，但是会产生错配，跟之前扩出的片段有点不一样，甚至出现了移位，你们拼接是先用软件拼接，然后设引物，用cDNA扩出全长吗
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10楼2014-07-23 16:04:12
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