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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？ 已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下 谢谢
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1楼 2014-07-07 16:14:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

茂林修竹7

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:36:07
张冰宝: 金币+4, ★有帮助 2014-07-10 08:08:34
以回收的片段为模板，用相同的引物再扩增一次，条带肯定很亮，然后回收！（如果条带不亮，第一次那个暗暗的条带 应该不是你的目的片段）
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将欲取之必先与之
9楼2014-07-09 08:11:37
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-07 20:38:27
简单点的就是用胶回收盒子里面的柱子重新富集一遍

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
2楼2014-07-07 16:19:56
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:35:55
柱子很多假货，小实验室尤其要注意咯。
如果不是假货，回收效率会在80%以上，你可以回收DNA marker做质控。
以前我也是回收效率低，做克隆做不出来，后来顶住压力，换了试剂盒，老师再也不用担心我克隆的问题了。
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8楼2014-07-08 22:11:31
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zixiao_226

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:36:18
可以浓缩下体积，最好是重新扩一次，会好点
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10楼2014-07-09 08:45:38
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:10:37
直接乙醇沉淀，跟你做质粒提取一样的节奏，乙醇沉淀重新融水，少融一点就OK了，不过我一般会直接上中间载体（从来不用T载体）
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15楼2014-07-10 11:29:57
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 08:41:58
我用你的方法试过了，结果却是没有p出我的目的条带。做的阳性对照p出来了，应该不是我操作或者体系有问题。我用的模板就是我回收的片段啊。不知什么原因？恳请帮忙分析一下...

这个我也不能确定的，1）第一次扩增的条带不是你的目的条带；2）是否回收到了？
另外，我不明白，你的阳性对照是什么？
既然有阳性对照，你为什么 不用阳性对照的模板做模板？
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将欲取之必先与之
24楼2014-07-21 09:02:25
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:24
引用回帖:
25楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 09:08:46
阳性对照就是我最开始pcr时使用的标准菌株模板。因为我要先连接t-载体后测序，测序后会有少许碱基突变，然后用突变的这个序列作为我的目的片段连接表达载体。
第一次扩增的是我的目的片段，不然测序就不会正确呀。...

嗯，这就是 常规的载体构建方法嘛。但是你的问题我还是不明白，越来越来越不明白了。
根据载体构建的常规步骤，1）PCR扩增目的基因，你原始的问题就是这步的扩增目的基因的时候条带不亮，我建议用回收片段再重新扩增。但是你有标准菌株的模板，而且你阳性对照也是很亮的，所以就不明白你的问题了。2）回收片段连接T-vector→测序→酶切→回收目的条带，如果你的问题是这步的回收条带不亮，那我当初的建议就是不可行的。这样的话，那是你酶切的质粒浓度不够，所以建议你重新提取这个中间载体的质粒，提高下浓度，你可以直接放在37℃的烘箱，开盖烘过夜，会蒸发一些水分，质粒的浓度就会提高些，你用这个酶切，回收，在连接你的表达载体。
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将欲取之必先与之
27楼2014-07-21 10:01:36
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:36
你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割困难，酶切时间短自然你基因条带弱
针对第二点，T载体上也是有不少酶切位点的，如果你的酶切时间不够或酶切位点甲基化，切割出现在载体的酶切位点上自然你要回收的序列会偏大。
针对第三点，你割胶回收后测过浓度吗？你的条带本身就很弱我估计你回收完都没东西了。
所以最好的解决办法就是延长切割时间，其次筛查你加的酶切位点是否有甲基化酶识别区导致甲基化。你有你酶切质粒的电泳图吗？能不能发出来看看你的图
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大家相互帮助哈
28楼2014-07-21 10:57:50
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:53:16
我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的 ...

你marker的最下方下面还长着呢，你下一次跑胶跑的时间长一些，这样能分的更开更容易判断，还有你如果实在担心偏大的问题，下一次跑顺便带一个以你模板扩增的PCR条带作为对照。
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大家相互帮助哈
32楼2014-07-21 12:31:29
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:38
引用回帖:
29楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:11:54
非常感谢你。是我没说清楚，其实我主要的问题就是你说的第二步。我已经重新提质粒了，质粒浓度还是挺高的，但是酶切回收后浓度就不是很高了，并且还有一个问题，就是我回收的目的条带总是偏高，我已经重新回收三次 ...

T-vector的测序结果是正确的，另外建议你还是要检查下 你目的基因5端、3端的酶切位点有没有错误，如果都没有问题的话，酶切目的条带偏高，应该没什么问题，可能是你marker的问题。
还有，酶切回收的浓度 不会很高的，但是一般连接时没有问题的。T4连接，你可以试试 16℃连接2h，转化的时候 全部涂板。
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47楼2014-07-21 17:40:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
55楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-23 08:54:51
1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的 ，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在 ...

10ul体系酶连16-20h后扩大体系至终体积20ul，补加T4酶和buffer再连接过夜试试。~一般二次酶连载体和基因量都得大点才好。
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57楼2014-07-23 19:17:13
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普通回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-07-22 20:43:59
我们实验室有专门抽真空的仪器呢

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天道酬勤
3楼2014-07-07 23:12:13
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_深海渔_

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-07-07 16:19:56
简单点的就是用胶回收盒子里面的柱子重新富集一遍

我最近也遇到这方面问题，您能详细的讲一下吗？把纯化回收的DNA溶液放到柱子里然后重新离心吗？谢谢！

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4楼2014-07-08 00:00:30
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-07-07 16:19:56
简单点的就是用胶回收盒子里面的柱子重新富集一遍

重新富集？能说的详细点吗？因为确实没做过。谢谢了
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5楼2014-07-08 08:28:28
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-07 23:12:13
我们实验室有专门抽真空的仪器呢

要是不具备这样的仪器，该怎么办啊
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6楼2014-07-08 08:28:59
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:35:37
乙醇沉淀。如果用柱子不能直接上吧，毕竟你的片段溶剂就是洗脱液。
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7楼2014-07-08 16:38:50
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