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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:17
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30楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:53:16
我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的 ...

1.从图上看，绝对切开了，你是割胶回收后再跑了一个不亮对吧，这个好办，多切个200ul，用透明胶带把你的大梳子粘在一起倒回收胶，这种大点样空至少能点200ul以上，开紫外割胶的时候一定要快，回收少很多问题出在这一步，50度融胶后不要立刻上柱子，晾至室温，离心尽量用温度低点的离心机，也可以反复过柱子都能提高回收效率。
2.从图上看确实有那么点偏大，你用哪两个酶切的？
3.而且以这个亮度就算回收效率再低也不至于二次PCR做不出来的地步。二次PCR加了多少模板？强烈建议LZ去测个回收后的浓度
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31楼2014-07-21 12:15:00
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:53:16
我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的 ...

你marker的最下方下面还长着呢，你下一次跑胶跑的时间长一些，这样能分的更开更容易判断，还有你如果实在担心偏大的问题，下一次跑顺便带一个以你模板扩增的PCR条带作为对照。
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32楼2014-07-21 12:31:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
其实偏大的问题不大，Marker也就是个对照，并不一定完全准确，一切还是以你连上表达载体后的测序结果为准。
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33楼2014-07-21 12:38:58
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张冰宝

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33楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 12:38:58
其实偏大的问题不大，Marker也就是个对照，并不一定完全准确，一切还是以你连上表达载体后的测序结果为准。

是这样，我上传的这个是质粒的双酶切，两个酶分别是EcoR1和xho1.我跑胶回收的是50微升的体系。回收后条带就在2000bp处。条带很浅，后来我重新酶切过一次，条带亮了很多，依然是偏高，就是没测浓度。我想知道我回收后的这个条带偏高对我连接表达载体有影响吗？
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34楼2014-07-21 12:59:55
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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31楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 12:15:00
1.从图上看，绝对切开了，你是割胶回收后再跑了一个不亮对吧，这个好办，多切个200ul，用透明胶带把你的大梳子粘在一起倒回收胶，这种大点样空至少能点200ul以上，开紫外割胶的时候一定要快，回收少很多问题出在这 ...

你的建议我在做实验的时候已经注意了，应该不是操作的问题吧。我一般PCR用的都是25微升的体系，模板加的是1.5微升。。测回收后的浓度要达到多少才能算是比较好的呢？是不是说我测浓度达到这个浓度 就没问题了呢
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35楼2014-07-21 13:03:46
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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32楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 12:31:29
你marker的最下方下面还长着呢，你下一次跑胶跑的时间长一些，这样能分的更开更容易判断，还有你如果实在担心偏大的问题，下一次跑顺便带一个以你模板扩增的PCR条带作为对照。...

如果比我的对照要高的话，能否说明我回收的有问题？不利于后续试验呢
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36楼2014-07-21 13:05:25
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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33楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 12:38:58
其实偏大的问题不大，Marker也就是个对照，并不一定完全准确，一切还是以你连上表达载体后的测序结果为准。

现在的问题是，我连不上表达载体了。找了很多原因，也做了很多次试验，就是连不上。所以想问一下是不是我回收的条带偏高和浓度有些低才导致的连接不上呢
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37楼2014-07-21 13:06:59
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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37楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 13:06:59
现在的问题是，我连不上表达载体了。找了很多原因，也做了很多次试验，就是连不上。所以想问一下是不是我回收的条带偏高和浓度有些低才导致的连接不上呢...

刚才的图上你下面的带没2000吧，怎么回收后成2000了呢。。。酶连基因浓度低当然会影响

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38楼2014-07-21 13:39:30
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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38楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 13:39:30
刚才的图上你下面的带没2000吧，怎么回收后成2000了呢。。。酶连基因浓度低当然会影响
...

这个酶切后要回收我的目的片段啊，回收后就2000bp了呢。切了好几次都是这样的
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39楼2014-07-21 13:59:45
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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38楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 13:39:30
刚才的图上你下面的带没2000吧，怎么回收后成2000了呢。。。酶连基因浓度低当然会影响
...

是啊 。切得时候没有两千，但是一回收就高。不知道怎么回事？更奇怪的是我同门她切胶回收的也高，但是她就连接上表达载体了，我这个死活连不上。找了n多原因
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40楼2014-07-21 14:01:07
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