20楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-16 17:20:57
有点不明白你的意思。你说的是克隆载体，是指T-vector吧？这个问题和你最初的问题不是一个吧？不明白你到底想问什么。
根据你测序的结果，有一个碱基突变，如果以此为模板（不考虑Taq酶的错配率），扩出来的pcr片 ...

9楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-09 08:11:37
以回收的片段为模板，用相同的引物再扩增一次，条带肯定很亮，然后回收！（如果条带不亮，第一次那个暗暗的条带 应该不是你的目的片段）

22楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 08:41:58
我用你的方法试过了，结果却是没有p出我的目的条带。做的阳性对照p出来了，应该不是我操作或者体系有问题。我用的模板就是我回收的片段啊。不知什么原因？恳请帮忙分析一下...

24楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 09:02:25
这个我也不能确定的，1）第一次扩增的条带不是你的目的条带；2）是否回收到了？
另外，我不明白，你的阳性对照是什么？
既然有阳性对照，你为什么 不用阳性对照的模板做模板？...

23楼: Originally posted by xiaohongma at 2014-07-21 08:53:29
打开盖子， 放到负80干燥，然后再加更少的水溶解就行了

25楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 09:08:46
阳性对照就是我最开始pcr时使用的标准菌株模板。因为我要先连接t-载体后测序，测序后会有少许碱基突变，然后用突变的这个序列作为我的目的片段连接表达载体。
第一次扩增的是我的目的片段，不然测序就不会正确呀。...

27楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 10:01:36
嗯，这就是 常规的载体构建方法嘛。但是你的问题我还是不明白，越来越来越不明白了。
根据载体构建的常规步骤，1）PCR扩增目的基因，你原始的问题就是这步的扩增目的基因的时候条带不亮，我建议用回收片段再重新扩 ...

28楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 10:57:50
你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割 ...