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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-16 17:20:57
有点不明白你的意思。你说的是克隆载体，是指T-vector吧？这个问题和你最初的问题不是一个吧？不明白你到底想问什么。
根据你测序的结果，有一个碱基突变，如果以此为模板（不考虑Taq酶的错配率），扩出来的pcr片 ...

不好意思啊 ，我没说明白。是t-vector。只要pcr扩出来了和我测序的序列是一致的就行。因为我要用这个测序的序列连表达载体。一般我都是双酶切，然后切胶回收自己的目的片段，但是总是条带很高，我也不知道怎么回事。后来看见你告诉我的方法，我觉得挺好的；所以想确定一下，扩出来的和我测序的是不是一致的。多谢啦。
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21楼2014-07-16 18:03:16
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-09 08:11:37
以回收的片段为模板，用相同的引物再扩增一次，条带肯定很亮，然后回收！（如果条带不亮，第一次那个暗暗的条带 应该不是你的目的片段）

我用你的方法试过了，结果却是没有p出我的目的条带。做的阳性对照p出来了，应该不是我操作或者体系有问题。我用的模板就是我回收的片段啊。不知什么原因？恳请帮忙分析一下
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22楼2014-07-21 08:41:58
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xiaohongma

新虫 (小有名气)
打开盖子， 放到负80干燥，然后再加更少的水溶解就行了

[ 发自小木虫客户端 ]
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23楼2014-07-21 08:53:29
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 08:41:58
我用你的方法试过了，结果却是没有p出我的目的条带。做的阳性对照p出来了，应该不是我操作或者体系有问题。我用的模板就是我回收的片段啊。不知什么原因？恳请帮忙分析一下...

这个我也不能确定的，1）第一次扩增的条带不是你的目的条带；2）是否回收到了？
另外，我不明白，你的阳性对照是什么？
既然有阳性对照，你为什么 不用阳性对照的模板做模板？
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将欲取之必先与之
24楼2014-07-21 09:02:25
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 09:02:25
这个我也不能确定的，1）第一次扩增的条带不是你的目的条带；2）是否回收到了？
另外，我不明白，你的阳性对照是什么？
既然有阳性对照，你为什么 不用阳性对照的模板做模板？...

阳性对照就是我最开始pcr时使用的标准菌株模板。因为我要先连接t-载体后测序，测序后会有少许碱基突变，然后用突变的这个序列作为我的目的片段连接表达载体。
第一次扩增的是我的目的片段，不然测序就不会正确呀。
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25楼2014-07-21 09:08:46
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by xiaohongma at 2014-07-21 08:53:29
打开盖子， 放到负80干燥，然后再加更少的水溶解就行了

放到负80干燥？ 这样就会浓度变高吗？
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26楼2014-07-21 09:10:37
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:24
引用回帖:
25楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 09:08:46
阳性对照就是我最开始pcr时使用的标准菌株模板。因为我要先连接t-载体后测序，测序后会有少许碱基突变，然后用突变的这个序列作为我的目的片段连接表达载体。
第一次扩增的是我的目的片段，不然测序就不会正确呀。...

嗯，这就是 常规的载体构建方法嘛。但是你的问题我还是不明白，越来越来越不明白了。
根据载体构建的常规步骤，1）PCR扩增目的基因，你原始的问题就是这步的扩增目的基因的时候条带不亮，我建议用回收片段再重新扩增。但是你有标准菌株的模板，而且你阳性对照也是很亮的，所以就不明白你的问题了。2）回收片段连接T-vector→测序→酶切→回收目的条带，如果你的问题是这步的回收条带不亮，那我当初的建议就是不可行的。这样的话，那是你酶切的质粒浓度不够，所以建议你重新提取这个中间载体的质粒，提高下浓度，你可以直接放在37℃的烘箱，开盖烘过夜，会蒸发一些水分，质粒的浓度就会提高些，你用这个酶切，回收，在连接你的表达载体。
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将欲取之必先与之
27楼2014-07-21 10:01:36
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:36
你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割困难，酶切时间短自然你基因条带弱
针对第二点，T载体上也是有不少酶切位点的，如果你的酶切时间不够或酶切位点甲基化，切割出现在载体的酶切位点上自然你要回收的序列会偏大。
针对第三点，你割胶回收后测过浓度吗？你的条带本身就很弱我估计你回收完都没东西了。
所以最好的解决办法就是延长切割时间，其次筛查你加的酶切位点是否有甲基化酶识别区导致甲基化。你有你酶切质粒的电泳图吗？能不能发出来看看你的图
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大家相互帮助哈
28楼2014-07-21 10:57:50
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 10:01:36
嗯，这就是 常规的载体构建方法嘛。但是你的问题我还是不明白，越来越来越不明白了。
根据载体构建的常规步骤，1）PCR扩增目的基因，你原始的问题就是这步的扩增目的基因的时候条带不亮，我建议用回收片段再重新扩 ...

非常感谢你。是我没说清楚，其实我主要的问题就是你说的第二步。我已经重新提质粒了，质粒浓度还是挺高的，但是酶切回收后浓度就不是很高了，并且还有一个问题，就是我回收的目的条带总是偏高，我已经重新回收三次了，都是这个状况，不知道是不是这样导致我后续的连接表达载体一直连接不上。
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29楼2014-07-21 11:11:54
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 10:57:50
你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割 ...

我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的marker量程是2500bp，其中从下往上第四条带是1500bp。我的目的条带就是1510bp。
目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
20140721_113601.jpg
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30楼2014-07-21 11:53:16
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