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张冰宝

新虫 (小有名气)

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虫号: 3004363
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专业: 地方病学

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下谢谢

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1楼 2014-07-07 16:14:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)

应助: 11 (小学生)
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专业: 作物种质资源与遗传育种学

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:24

引用回帖:

25楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 09:08:46
阳性对照就是我最开始pcr时使用的标准菌株模板。因为我要先连接t-载体后测序，测序后会有少许碱基突变，然后用突变的这个序列作为我的目的片段连接表达载体。
第一次扩增的是我的目的片段，不然测序就不会正确呀。...

嗯，这就是常规的载体构建方法嘛。但是你的问题我还是不明白，越来越来越不明白了。
根据载体构建的常规步骤，1）PCR扩增目的基因，你原始的问题就是这步的扩增目的基因的时候条带不亮，我建议用回收片段再重新扩增。但是你有标准菌株的模板，而且你阳性对照也是很亮的，所以就不明白你的问题了。2）回收片段连接T-vector→测序→酶切→回收目的条带，如果你的问题是这步的回收条带不亮，那我当初的建议就是不可行的。这样的话，那是你酶切的质粒浓度不够，所以建议你重新提取这个中间载体的质粒，提高下浓度，你可以直接放在37℃的烘箱，开盖烘过夜，会蒸发一些水分，质粒的浓度就会提高些，你用这个酶切，回收，在连接你的表达载体。