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张冰宝

新虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
金币: 427.2
帖子: 158
在线: 41.7小时
虫号: 3004363
注册: 2014-02-28
性别: MM
专业: 地方病学

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下谢谢

回复此楼

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1楼 2014-07-07 16:14:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
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性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:36

你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割困难，酶切时间短自然你基因条带弱
针对第二点，T载体上也是有不少酶切位点的，如果你的酶切时间不够或酶切位点甲基化，切割出现在载体的酶切位点上自然你要回收的序列会偏大。
针对第三点，你割胶回收后测过浓度吗？你的条带本身就很弱我估计你回收完都没东西了。
所以最好的解决办法就是延长切割时间，其次筛查你加的酶切位点是否有甲基化酶识别区导致甲基化。你有你酶切质粒的电泳图吗？能不能发出来看看你的图