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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？ 已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下 谢谢
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1楼 2014-07-07 16:14:58
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 11:02:36
你连上T载体测序除了一个点突变其他的位置正确对吧，你现在的问题是1.你切胶回收后比较暗，2.条带偏大，3.以胶回收产物二次PCR无条带。
针对第一点，首先你要考虑你酶切完全不完全~或者你的酶切位点甲基化导致切割困难，酶切时间短自然你基因条带弱
针对第二点，T载体上也是有不少酶切位点的，如果你的酶切时间不够或酶切位点甲基化，切割出现在载体的酶切位点上自然你要回收的序列会偏大。
针对第三点，你割胶回收后测过浓度吗？你的条带本身就很弱我估计你回收完都没东西了。
所以最好的解决办法就是延长切割时间，其次筛查你加的酶切位点是否有甲基化酶识别区导致甲基化。你有你酶切质粒的电泳图吗？能不能发出来看看你的图
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28楼2014-07-21 10:57:50
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:17
引用回帖:
30楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:53:16
我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的 ...

1.从图上看，绝对切开了，你是割胶回收后再跑了一个不亮对吧，这个好办，多切个200ul，用透明胶带把你的大梳子粘在一起倒回收胶，这种大点样空至少能点200ul以上，开紫外割胶的时候一定要快，回收少很多问题出在这一步，50度融胶后不要立刻上柱子，晾至室温，离心尽量用温度低点的离心机，也可以反复过柱子都能提高回收效率。
2.从图上看确实有那么点偏大，你用哪两个酶切的？
3.而且以这个亮度就算回收效率再低也不至于二次PCR做不出来的地步。二次PCR加了多少模板？强烈建议LZ去测个回收后的浓度
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31楼2014-07-21 12:15:00
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:53:16
我做的是双酶切，37度水浴2小时。应该不存在切不开的现象。回收后没测过浓度，因为跑胶条带就不是很亮，所以觉得浓度会比较低。酶切位点甲基化是怎么回事啊？确实不太懂，我应该怎么筛查呢？还请指教。
图中左侧的 ...

你marker的最下方下面还长着呢，你下一次跑胶跑的时间长一些，这样能分的更开更容易判断，还有你如果实在担心偏大的问题，下一次跑顺便带一个以你模板扩增的PCR条带作为对照。
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32楼2014-07-21 12:31:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
其实偏大的问题不大，Marker也就是个对照，并不一定完全准确，一切还是以你连上表达载体后的测序结果为准。
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33楼2014-07-21 12:38:58
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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37楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 13:06:59
现在的问题是，我连不上表达载体了。找了很多原因，也做了很多次试验，就是连不上。所以想问一下是不是我回收的条带偏高和浓度有些低才导致的连接不上呢...

刚才的图上你下面的带没2000吧，怎么回收后成2000了呢。。。酶连基因浓度低当然会影响

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38楼2014-07-21 13:39:30
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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40楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 14:01:07
是啊 。切得时候没有两千，但是一回收就高。不知道怎么回事？更奇怪的是我同门她切胶回收的也高，但是她就连接上表达载体了，我这个死活连不上。找了n多原因...

那就只说你酶切酶连的问题吧，你不测浓度怎么算摩尔数，不算摩尔数怎么算摩尔比？如果次次都是估算那是很不可靠的。

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43楼2014-07-21 14:56:11
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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44楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 14:57:48
好的 明白了。非常感谢您的帮助。我在重新试一下...

一般的说明书上 载体0.03pmol  基因0.03pmol-0.3pmol 10ul体系酶连16度12-20小时，也可以扩大体系后二次酶连效果更好，再设置阳性对照检测感受态转化效率就没啥问题了，你以前做转化平板上是啥也没有还是有含空载体的假阳性？

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45楼2014-07-21 15:29:24
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luwei13566

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:53
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51楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 15:22:11
好的 我重新回收后测了浓度 结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因...

看来就是你割胶回收的问题了。优化下酶连体系吧
1.你的表达载体多大？也是割胶回收的吧，估计浓度也不高。以后载体双酶切后可以直接用PCR产物纯化试剂盒纯化，不割胶估计损失会小些，纯化后也测个浓度。你这次又涂了几个平板还是有转化子长出来但都是假阳性吗，本来你割胶回收后量就少如果还有假阳性那你载体的双酶切时间还得延长。你想想本来就少，如果还有没切开的那自然更连不上了，载体的浓度是你后期转化子多少的关键。
2.既然你是从T载体上切基因，那肯定是双酶切的产物而且必须割胶，那你以后基因再多加点，你现在连接体系是怎么分配的？基因多少，载体多少，体系多大？你基因浓度实在上不去的话那以后酶连体系不要加水全加基因。
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52楼2014-07-22 19:09:09
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luwei13566

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51楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 15:22:11
好的 我重新回收后测了浓度 结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因...

还有你既然测了浓度，你DNA的260/230是多少，不高吧？
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53楼2014-07-22 19:14:30
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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55楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-23 08:54:51
1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的 ，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在 ...

基因：载体：buffer：酶=6:2:1:1试试
载体的浓度也得测一下
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56楼2014-07-23 19:13:16
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