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张冰宝

新虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
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专业: 地方病学

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下谢谢

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1楼 2014-07-07 16:14:58

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张冰宝

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

52楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-22 19:09:09
看来就是你割胶回收的问题了。优化下酶连体系吧
1.你的表达载体多大？也是割胶回收的吧，估计浓度也不高。以后载体双酶切后可以直接用PCR产物纯化试剂盒纯化，不割胶估计损失会小些，纯化后也测个浓度。你这次又涂 ...

1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在载体上非常接近，所以不好辨认是否切开，但是我用我同门切好的也是连不上，（我同门连上了）。所以应该不是表达载体的问题。
4.我现在的连接体系是：5微升体系：（基因3ul。载体1ul。T4buffer 0.5ul。T4酶0.5ul）
10微升体系：（基因6ul，载体1ul，buffer1ul，酶1ul，水1ul）
不加水全加基因我也试过，但是也是每长菌。所以我想可能是我的回收片段有问题