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张冰宝

新虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
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帖子: 158
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虫号: 3004363
注册: 2014-02-28
性别: MM
专业: 地方病学

[求助] 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？已有6人参与

我回收了我的目的片段，条带很暗且稍偏高，浓度有些低，连接表达载体一直连接不上，希望可以把我的目的片段浓缩一下。不知道该如何浓缩，希望知道的大侠们指点一下谢谢

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1楼 2014-07-07 16:14:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
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性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:53

引用回帖:

51楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 15:22:11
好的我重新回收后测了浓度结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因...

看来就是你割胶回收的问题了。优化下酶连体系吧
1.你的表达载体多大？也是割胶回收的吧，估计浓度也不高。以后载体双酶切后可以直接用PCR产物纯化试剂盒纯化，不割胶估计损失会小些，纯化后也测个浓度。你这次又涂了几个平板还是有转化子长出来但都是假阳性吗，本来你割胶回收后量就少如果还有假阳性那你载体的双酶切时间还得延长。你想想本来就少，如果还有没切开的那自然更连不上了，载体的浓度是你后期转化子多少的关键。
2.既然你是从T载体上切基因，那肯定是双酶切的产物而且必须割胶，那你以后基因再多加点，你现在连接体系是怎么分配的？基因多少，载体多少，体系多大？你基因浓度实在上不去的话那以后酶连体系不要加水全加基因。