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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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50楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-22 12:01:30
现在 我也不确定什么问题了。我们实验室早就不用T4连接了，这个效率本身就不高。...

好的 我重新回收后测了浓度 结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因
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51楼2014-07-22 15:22:11
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:53
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51楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 15:22:11
好的 我重新回收后测了浓度 结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因...

看来就是你割胶回收的问题了。优化下酶连体系吧
1.你的表达载体多大？也是割胶回收的吧，估计浓度也不高。以后载体双酶切后可以直接用PCR产物纯化试剂盒纯化，不割胶估计损失会小些，纯化后也测个浓度。你这次又涂了几个平板还是有转化子长出来但都是假阳性吗，本来你割胶回收后量就少如果还有假阳性那你载体的双酶切时间还得延长。你想想本来就少，如果还有没切开的那自然更连不上了，载体的浓度是你后期转化子多少的关键。
2.既然你是从T载体上切基因，那肯定是双酶切的产物而且必须割胶，那你以后基因再多加点，你现在连接体系是怎么分配的？基因多少，载体多少，体系多大？你基因浓度实在上不去的话那以后酶连体系不要加水全加基因。
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52楼2014-07-22 19:09:09
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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51楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 15:22:11
好的 我重新回收后测了浓度 结果是15.7。我觉得这个浓度太小可能导致我连接不上吧。还是谢谢你啦、我在慢慢找找原因...

还有你既然测了浓度，你DNA的260/230是多少，不高吧？
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53楼2014-07-22 19:14:30
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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53楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-22 19:14:30
还有你既然测了浓度，你DNA的260/230是多少，不高吧？...

1.65.应该就是没有回收好吧。跑大胶就是浅浅的带。
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54楼2014-07-23 08:43:12
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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52楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-22 19:09:09
看来就是你割胶回收的问题了。优化下酶连体系吧
1.你的表达载体多大？也是割胶回收的吧，估计浓度也不高。以后载体双酶切后可以直接用PCR产物纯化试剂盒纯化，不割胶估计损失会小些，纯化后也测个浓度。你这次又涂 ...

1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的 ，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在载体上非常接近，所以不好辨认是否切开，但是我用我同门切好的也是连不上，（我同门连上了）。所以应该不是表达载体的问题。
4.我现在的连接体系是：5微升体系：（基因3ul。载体1ul。T4buffer  0.5ul。T4酶0.5ul）
10微升体系：（基因6ul，载体1ul，buffer1ul，酶1ul，水1ul）
不加水全加基因我也试过，但是也是每长菌。所以我想可能是我的回收片段有问题
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55楼2014-07-23 08:54:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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55楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-23 08:54:51
1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的 ，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在 ...

基因：载体：buffer：酶=6:2:1:1试试
载体的浓度也得测一下
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56楼2014-07-23 19:13:16
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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55楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-23 08:54:51
1.我的表达载体是5900bp，我是直接就是酶切产物回收的 ，就是怕损失。
2.这次涂了两个平板，自己转化的那个板没长，另一个是商品化的阳性质粒，长了满板。可以排除板子和感受态的问题
3.是因为我的两个酶切位点在 ...

10ul体系酶连16-20h后扩大体系至终体积20ul，补加T4酶和buffer再连接过夜试试。~一般二次酶连载体和基因量都得大点才好。
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57楼2014-07-23 19:17:13
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张冰宝

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57楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-23 19:17:13
10ul体系酶连16-20h后扩大体系至终体积20ul，补加T4酶和buffer再连接过夜试试。~一般二次酶连载体和基因量都得大点才好。...

就是说二次酶连时我只加T4和buffer就行是吗？那我要加多少呢？多出来的是不是要用水补齐至20ul？
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58楼2014-07-24 08:42:36
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张冰宝

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56楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-23 19:13:16
基因：载体：buffer：酶=6:2:1:1试试
载体的浓度也得测一下...

这个比例我试过，那次结果是没有长菌。
现在回收后的浓度我都会测一下，但是事实是根本达不到想要的浓度。一般都很低
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59楼2014-07-24 08:44:34
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张冰宝

新虫 (小有名气)
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53楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-22 19:14:30
还有你既然测了浓度，你DNA的260/230是多少，不高吧？...

我能问一下，为什么是260/230吗？我师姐告诉我说我们只要看260/280就可以。说要达到1.8-2.0才算比较好
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60楼2014-07-24 08:46:01
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