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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zixiao_226 at 2014-07-09 08:45:38
可以浓缩下体积，最好是重新扩一次，会好点

如何浓缩体积 呢
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11楼2014-07-10 08:09:14
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-08 16:38:50
乙醇沉淀。如果用柱子不能直接上吧，毕竟你的片段溶剂就是洗脱液。

乙醇沉淀？是我用回收好的直接加乙醇进行沉淀吗？能详细说一下吗
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12楼2014-07-10 10:31:12
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zixiao_226 at 2014-07-09 08:45:38
可以浓缩下体积，最好是重新扩一次，会好点

如何浓缩体积？能具体说一下吗 ？谢谢
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13楼2014-07-10 10:31:49
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-10 10:31:12
乙醇沉淀？是我用回收好的直接加乙醇进行沉淀吗？能详细说一下吗...

直接加乙醇沉淀
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14楼2014-07-10 10:54:54
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:10:37
直接乙醇沉淀，跟你做质粒提取一样的节奏，乙醇沉淀重新融水，少融一点就OK了，不过我一般会直接上中间载体（从来不用T载体）
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15楼2014-07-10 11:29:57
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-09 08:11:37
以回收的片段为模板，用相同的引物再扩增一次，条带肯定很亮，然后回收！（如果条带不亮，第一次那个暗暗的条带 应该不是你的目的片段）

我还有个小问题想请教一下。我现在回收的目的片段是连完克隆载体后酶切回收的。测序显示有一些位点突变了。那么我按照你的方法扩增，其中突变的点会不会影响我的序列。换句话说pcr扩增完后的序列和我测序回来的序列是一模一样的吗？因为不是很懂所以恳请指点
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16楼2014-07-16 15:35:11
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-07-07 16:19:56
简单点的就是用胶回收盒子里面的柱子重新富集一遍

我按照你的方法试过了，的确浓度变高了。非常感谢。只是浓度变高了以后条带却还是偏高。高于我的目的片段500bp。是我胶回收的问题吗？我重新胶回收三次了，结果却都是偏高。做双酶切时还好，回收后就不行了。我一直在用这个连表达载体，始终连不上不知道是不是这个的原因。恳请赐教谢谢
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17楼2014-07-16 15:39:06
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-08 16:38:50
乙醇沉淀。如果用柱子不能直接上吧，毕竟你的片段溶剂就是洗脱液。

不能直接上柱 啊？是不是 在我回收的目的片段溶液加入乙醇？那我该加多少呢。谢谢
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18楼2014-07-16 15:40:39
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zixiao_226 at 2014-07-09 08:45:38
可以浓缩下体积，最好是重新扩一次，会好点

我是用回收的目的片段连接表达载体的。克隆载体已经连上了 且测序正确。只是连表达一直连不上。
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19楼2014-07-16 15:41:56
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-16 19:52:03
引用回帖:
16楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-16 15:35:11
我还有个小问题想请教一下。我现在回收的目的片段是连完克隆载体后酶切回收的。测序显示有一些位点突变了。那么我按照你的方法扩增，其中突变的点会不会影响我的序列。换句话说pcr扩增完后的序列和我测序回来的序列 ...

有点不明白你的意思。你说的是克隆载体，是指T-vector吧？这个问题和你最初的问题不是一个吧？不明白你到底想问什么。
根据你测序的结果，有一个碱基突变，如果以此为模板（不考虑Taq酶的错配率），扩出来的pcr片段肯定也会有一个碱基突变的。
另外碱基突变不代表翻译的氨基酸序列的突变，你可以比对下 氨基酸序列，如果正确的话，也是可以用的。
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将欲取之必先与之
20楼2014-07-16 17:20:57
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