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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 目的片段回收后浓度较低，如何浓缩？
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xiaohongma

新虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 09:10:37
放到负80干燥？ 这样就会浓度变高吗？...

-80干燥以后，没有水了，你再少加点水进去不就相当于浓缩了么？你合成的引物不也是要加水稀释么？

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41楼2014-07-21 14:22:23
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
41楼: Originally posted by xiaohongma at 2014-07-21 14:22:23
-80干燥以后，没有水了，你再少加点水进去不就相当于浓缩了么？你合成的引物不也是要加水稀释么？
...

哦 这样啊 。明白啦。非常感谢 。-80干燥难道不会冻成冰吗，为什么不用烘箱呢？
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42楼2014-07-21 14:25:56
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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40楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 14:01:07
是啊 。切得时候没有两千，但是一回收就高。不知道怎么回事？更奇怪的是我同门她切胶回收的也高，但是她就连接上表达载体了，我这个死活连不上。找了n多原因...

那就只说你酶切酶连的问题吧，你不测浓度怎么算摩尔数，不算摩尔数怎么算摩尔比？如果次次都是估算那是很不可靠的。

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大家相互帮助哈
43楼2014-07-21 14:56:11
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
43楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 14:56:11
那就只说你酶切酶连的问题吧，你不测浓度怎么算摩尔数，不算摩尔数怎么算摩尔比？如果次次都是估算那是很不可靠的。
...

好的 明白了。非常感谢您的帮助。我在重新试一下
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44楼2014-07-21 14:57:48
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
44楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 14:57:48
好的 明白了。非常感谢您的帮助。我在重新试一下...

一般的说明书上 载体0.03pmol  基因0.03pmol-0.3pmol 10ul体系酶连16度12-20小时，也可以扩大体系后二次酶连效果更好，再设置阳性对照检测感受态转化效率就没啥问题了，你以前做转化平板上是啥也没有还是有含空载体的假阳性？

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大家相互帮助哈
45楼2014-07-21 15:29:24
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
45楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 15:29:24
一般的说明书上 载体0.03pmol  基因0.03pmol-0.3pmol 10ul体系酶连16度12-20小时，也可以扩大体系后二次酶连效果更好，再设置阳性对照检测感受态转化效率就没啥问题了，你以前做转化平板上是啥也没有还是有含空载体 ...

做了大概十次，有两次板子上长了两三个菌落，我做的菌液pcr证实均为假阳性。找了很多原因。今天下午又转了一次，还转了个阳性质粒，让我同门给我做一次。看是不是手法等问题。结果明天就能知道啦。。哎
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46楼2014-07-21 16:40:06
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:44:38
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29楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 11:11:54
非常感谢你。是我没说清楚，其实我主要的问题就是你说的第二步。我已经重新提质粒了，质粒浓度还是挺高的，但是酶切回收后浓度就不是很高了，并且还有一个问题，就是我回收的目的条带总是偏高，我已经重新回收三次 ...

T-vector的测序结果是正确的，另外建议你还是要检查下 你目的基因5端、3端的酶切位点有没有错误，如果都没有问题的话，酶切目的条带偏高，应该没什么问题，可能是你marker的问题。
还有，酶切回收的浓度 不会很高的，但是一般连接时没有问题的。T4连接，你可以试试 16℃连接2h，转化的时候 全部涂板。
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将欲取之必先与之
47楼2014-07-21 17:40:29
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
47楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 17:40:29
T-vector的测序结果是正确的，另外建议你还是要检查下 你目的基因5端、3端的酶切位点有没有错误，如果都没有问题的话，酶切目的条带偏高，应该没什么问题，可能是你marker的问题。
还有，酶切回收的浓度 不会很高 ...

恩 昨天涂得板子对照 阳性质粒长了。我连接的那个每长。 我一般都是 16度过夜连接，转化时全部涂板。哎不知道问啥不长
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48楼2014-07-22 09:12:50
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
47楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-07-21 17:40:29
T-vector的测序结果是正确的，另外建议你还是要检查下 你目的基因5端、3端的酶切位点有没有错误，如果都没有问题的话，酶切目的条带偏高，应该没什么问题，可能是你marker的问题。
还有，酶切回收的浓度 不会很高 ...

我确定了一下 ，还让同门帮看了 设计的引物与酶切位点什么的都是对的。
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49楼2014-07-22 10:36:47
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
49楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-22 10:36:47
我确定了一下 ，还让同门帮看了 设计的引物与酶切位点什么的都是对的。...

现在 我也不确定什么问题了。我们实验室早就不用T4连接了，这个效率本身就不高。
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将欲取之必先与之
50楼2014-07-22 12:01:30
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