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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 普通PCR遇到的问题，求助大神们
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 普通PCR遇到的问题，求助大神们 已有6人参与

扩全长基因，基因大小825bp。八个温度梯度（52.5-54）,上下游引物Tm值分别为47.1、51.6、选用这个温度是因为之前梯度PCR未出来条带，在53度有杂带。图片如下，我应该怎么继续优化条件，虫虫们指导一下。谢谢啦

普通PCR遇到的问题，求助大神们
20140630-2_副本.jpg
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踏实
1楼 2014-07-02 13:16:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-02 15:37:30
内容已删除
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rainwater
2楼2014-07-02 13:51:01
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-02 13:51:01
应该是引物设计的不好，引物的Tm值太低。关于53℃有杂带的问题，有几个方面减少非特异性扩增，一方面采用热启动酶，另外可以添加一些PCR添加剂，如甜菜碱，DMSO等；还可以采用降落PCR的方法减少非特异性扩增。最好将 ...

扩全长，避免发夹结构，这个引物差不多只能这样啦。要不就出现发夹结构了
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踏实
3楼2014-07-02 13:55:22
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只能说引物不行  温度太低  小900的片段引物设计好不会很难的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-07-04 08:12:09
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普通回帖

流氓一个

金虫 (正式写手)
Tm值相差好几度 没问题么
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我有我人生
4楼2014-07-02 16:49:24
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aini_222925

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-03 12:22:15
这非特异也太严重了，换个酶试试看。
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我是疯子我怕谁
5楼2014-07-02 17:21:19
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-03 12:22:22
升高温度试试吧，能降低非特异性带
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6楼2014-07-02 18:19:59
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-02 13:51:01
应该是引物设计的不好，引物的Tm值太低。关于53℃有杂带的问题，有几个方面减少非特异性扩增，一方面采用热启动酶，另外可以添加一些PCR添加剂，如甜菜碱，DMSO等；还可以采用降落PCR的方法减少非特异性扩增。最好将 ...

好的，谢谢，我这几天就着手再试试
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踏实
7楼2014-07-03 16:12:40
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335341312

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-02 13:55:22
扩全长，避免发夹结构，这个引物差不多只能这样啦。要不就出现发夹结构了...

引物里面即使有发夹结构也能扩出来，只要3‘端没有就可以
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8楼2014-07-03 16:25:54
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-04 22:57:40
你最下面的引物二聚体也太亮了，引物少加点，看引物问题不是很大，关键是用什么做的模板，质粒的话很容易就扩出来了，基因组或者cDNA的话关键是要保证模板质量，10倍稀释后退火温度用55°扩扩看
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10楼2014-07-04 14:56:15
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