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gg880712

新虫 (初入文坛)

[求助] 最近做western blot 遇到问题,请各路大神指教已有2人参与

小的做一个外泌蛋白的western,用flag标签标记了这个蛋白,目的大小预测为71KD,如果去掉信号肽的话也有69KD,但杂交总得到两条条带,一条是70KD左右的目的条带,另一条大概60KD左右,甚至条带比目的条带还要深,感觉不像杂带。
        请问大神们这是怎么一回事?会不会和信号肽有关系?会不会和蛋白构象有关系?
        坐等指教啊!

最近做western blot 遇到问题,请各路大神指教
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gg880712

新虫 (初入文坛)

有没有人帮帮我啊。。。
2楼2014-05-07 10:11:57
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jurkat.1640

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也是用Flag,也有多带。用多克隆抗体的时候还有比目的带强的杂带,多克隆抗体也会有杂带。
3楼2014-05-08 09:18:29
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gg880712

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-08 09:18:29
我也是用Flag,也有多带。用多克隆抗体的时候还有比目的带强的杂带,多克隆抗体也会有杂带。

就是说有杂带是正常现象?
4楼2014-05-08 10:45:04
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gg880712: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-05-08 12:31:54
有杂带是正常情况
尤其是你自己制作的抗体,更是如此。
但是你的图显示那个应该不是杂带,因为你的其他背景比较干净。
可能情况是,该基因是否只有一种剪切表达形式?
另外,你用大胶跑一下,你的条带分的不是太明显
最后,如果条件允许,做个双向电泳看看到底是啥情况,说不定是个新发现
天行健
5楼2014-05-08 10:54:38
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gg880712

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-05-08 10:54:38
有杂带是正常情况
尤其是你自己制作的抗体,更是如此。
但是你的图显示那个应该不是杂带,因为你的其他背景比较干净。
可能情况是,该基因是否只有一种剪切表达形式?
另外,你用大胶跑一下,你的条带分的不是太 ...

谢谢啦~我对蛋白了解不多,想请教下什么是蛋白的剪切表达形式?
我这个蛋白是几丁质酶,酶会有不同的剪切表达形式么?
6楼2014-05-08 12:31:07
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

引用回帖:
6楼: Originally posted by gg880712 at 2014-05-08 12:31:07
谢谢啦~我对蛋白了解不多,想请教下什么是蛋白的剪切表达形式?
我这个蛋白是几丁质酶,酶会有不同的剪切表达形式么?...

剪切是RNA剪切,一个基因可能会有多个表达蛋白,比如某个外显子子被剪切掉或者内含子保留等,从而翻译出来的蛋白发生改变。
酶可能存在不同的异构体
天行健
7楼2014-05-08 14:33:50
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gg880712

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-05-08 14:33:50
剪切是RNA剪切,一个基因可能会有多个表达蛋白,比如某个外显子子被剪切掉或者内含子保留等,从而翻译出来的蛋白发生改变。
酶可能存在不同的异构体...

嗯 我这个是细菌里的,所以应该不存在内含子啥的了。
如果有异构体的话,western上样前蛋白不是都煮了?
煮了以后所有结构应该都破坏了吧?
8楼2014-05-08 14:54:11
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jurkat.1640

铁杆木虫 (文坛精英)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gg880712 at 2014-05-08 10:45:04
就是说有杂带是正常现象?...

Yes
9楼2014-05-08 18:38:47
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