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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 急求：免疫共沉淀求助！
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环形山川

铜虫 (初入文坛)

[求助] 急求：免疫共沉淀求助！ 已有3人参与

做了免疫共沉淀然后跑WESTERN,考马斯亮蓝染胶，过夜，清洗，至始至终目的和对照只有IgG重链条带,其它再没了。另外一个是细胞裂解液INPUT，没有发现异样。照理说怎么可能只有重链没轻链呢，难道是蛋白量少了（我提的是600UG蛋白）？还是蛋白和珠子结合太紧密（100度5min处理）？求各位大神指教啊！
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1楼 2014-03-18 16:52:58
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
环形山川: 金币+1, ★有帮助 2014-03-18 17:17:15
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-19 16:01:42
首先，考马斯亮蓝染色，分辨率低，最好做western
其次，轻链很小，20kd左右，不知你胶跑开没有，另外还是考马原因，辨识度低
最后，总结下，还是用抗体检测比较靠谱
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多情总被无情扰。。。愁
2楼2014-03-18 16:59:19
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环形山川

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiaolong11a at 2014-03-18 16:59:19
首先，考马斯亮蓝染色，分辨率低，最好做western
其次，轻链很小，20kd左右，不知你胶跑开没有，另外还是考马原因，辨识度低
最后，总结下，还是用抗体检测比较靠谱

我这个主要找的是结合蛋白，所以必须要考染然后结合PULLDOWN做质谱的，所以做不了WESTERN，然后我用的是12%的胶和10%的胶都试过了，结果一样，25KD那里是白板。。。
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3楼2014-03-18 17:15:32
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 环形山川 at 2014-03-18 17:15:32
我这个主要找的是结合蛋白，所以必须要考染然后结合PULLDOWN做质谱的，所以做不了WESTERN，然后我用的是12%的胶和10%的胶都试过了，结果一样，25KD那里是白板。。。...

哦，这个不知道了，没经验
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多情总被无情扰。。。愁
4楼2014-03-19 08:47:12
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的也是没见轻链，但是抗体跑胶染色有轻链
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5楼2014-03-19 10:24:07
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-03-19 10:24:07
我的也是没见轻链，但是抗体跑胶染色有轻链

后期怎么继续使得敏感性较高呢
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6楼2014-03-19 10:38:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-03-19 10:38:23
后期怎么继续使得敏感性较高呢...

彩色扫描不敏感，用黑白扫描。用银染肯定可以看到。
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7楼2014-03-19 16:07:22
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-03-19 16:07:22
彩色扫描不敏感，用黑白扫描。用银染肯定可以看到。...

哦哦，好的，谢啦，可以试试
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8楼2014-03-19 19:51:52
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蕉鹿殇

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你的目标蛋白是胞质蛋白还是膜蛋白？用的哪家哪种RIPA？最好是有成分。轻链理论上用10%的胶是可以看到的。1，试一下全程用80～100V跑，最好用现稀释的缓冲液。2，考染前加一个固定的步骤吧。
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9楼2014-04-20 16:53:29
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