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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助 免疫共沉淀实验
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寒蕤

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助 免疫共沉淀实验 已有8人参与

各位好！小妹最近在做免疫共沉淀实验，但是几轮下来没有得到结果。我用的是10cm的皿，加入500ul-600ul裂解液，protein G beads的量为40ul，一抗为1.5ug。
抗体先和上清裂解液4度孵育过夜，然后又加beads4度孵育4h。最后用裂解液洗三次。做了western后可以检测到目的蛋白，但是没有检测到相互作用蛋白。希望大家给点建议。谢谢！
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1楼 2011-03-07 14:57:56
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2): 欢迎交流~~可以再说的详细点 2011-03-07 18:21:24
可能细胞量不够
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2楼2011-03-07 17:05:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 19:45:06
但是没有检测到相互作用蛋白

说不定就没有发生相互作用……
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3楼2011-03-07 17:08:08
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寒蕤

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jurkat.1640 at 2011-03-07 17:05:38:
可能细胞量不够

10cm皿的细胞不够吗？
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4楼2011-03-07 17:24:34
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寒蕤

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-07 17:08:08:
但是没有检测到相互作用蛋白

说不定就没有发生相互作用……

但是之前实验室的师兄通过串联亲和纯化（TAP）的方法吊到了与目的蛋白相互作用的蛋白了，现在导师就是让我要CoIP做出来。但是不知道为什么，CoIP就出不来了？现在希望大家可以指点一下。谢谢了！
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5楼2011-03-07 17:28:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+2): 鼓励交流~ 2011-03-07 18:20:16
裂解液是什么？RIPA？貌似还有更加温和的，看看会不会是缓冲体系或者裂解液的原因导致相互作用消失
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6楼2011-03-07 17:52:55
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寒蕤

铜虫 (小有名气)
★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-03-07 20:01:16
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-07 17:52:55:
裂解液是什么？RIPA？貌似还有更加温和的，看看会不会是缓冲体系或者裂解液的原因导致相互作用消失

我用的裂解液是150mMNaCl,10mMTris-HCl pH8.0,1%NP40,1mM PMSF.
是不是去垢剂用CHAPS比NP40更好呢？这两个有什么区别？它们的浓度用多大比较合适呢？谢谢！
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7楼2011-03-07 19:41:30
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wyyun3025

新虫 (初入文坛)
我正准备做免疫沉淀
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8楼2011-03-07 20:09:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by 寒蕤 at 2011-03-07 19:41:30:
我用的裂解液是150mMNaCl,10mMTris-HCl pH8.0,1%NP40,1mM PMSF.
是不是去垢剂用CHAPS比NP40更好呢？这两个有什么区别？它们的浓度用多大比较合适呢？谢谢！

这个我就不知道了，我只知道可以在这些上面下点功夫~~因为不同强度的配方对做IP的影响还是不小的
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9楼2011-03-07 20:41:36
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寒蕤

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-07 20:41:36:
这个我就不知道了，我只知道可以在这些上面下点功夫~~因为不同强度的配方对做IP的影响还是不小的

哦，已经很感谢了！
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10楼2011-03-07 21:15:59
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