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liujun1102

金虫 (正式写手)

[求助] 关于做染色质免疫共沉淀的几个问题，请高手赐教

小弟现在想做染色质免疫共沉淀，有几个问题。第一，用的枪头及EP管等等需要高压灭菌吗？第二，TE缓冲液能用双蒸水代替吗？如果能代替那么双蒸水需要灭菌吗？
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1楼 2013-06-05 15:16:37
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liujun1102: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-06-09 10:44:25
灭菌是生物实验最基本的要求, 灭菌的同时也把可能污染的蛋白, DNA破坏掉. 公司卖的都说他们已经灭过菌了. 理论上你不用再做一次, 当然如果你实验式里用的这些东西来自信誉可靠的公司.
第二个你是不是指最后得到的DNA? 因为貌似之后最后纯化DNA时用到TE. 这个不能用双蒸水, 因为对长期保存DNA不利, 如果你担心TE里面的EDTA会影响PCR, 你可以用10mM Tris(pH 8.0) 代替.
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2楼2013-06-05 17:29:55
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liujun1102

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-06-05 17:29:55
灭菌是生物实验最基本的要求, 灭菌的同时也把可能污染的蛋白, DNA破坏掉. 公司卖的都说他们已经灭过菌了. 理论上你不用再做一次, 当然如果你实验式里用的这些东西来自信誉可靠的公司.
第二个你是不是指最后得到的D ...

用TE不是最后保存DNA用，是IP之后解交联之前，洗抗体什么的用。最后DNA保存在elution buffer中
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3楼2013-06-06 08:57:55
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

明白, 我不用TE的, 洗完LiCl就是elution buffer了. 但是能不能用纯水代替我说不准.
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4楼2013-06-06 15:52:20
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liujun1102

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-06-06 15:52:20
明白, 我不用TE的, 洗完LiCl就是elution buffer了. 但是能不能用纯水代替我说不准.

问下，有了input了，还用做actin内参吗？IP之后提纯的DNA是不是只是和抗体结合的DNA，还能做出来actin内参吗？如果能做出来，那么做actin是不是就不用做input了？高手回答
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5楼2013-06-08 13:52:26
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

需要, 因为不管怎么洗脱, 非特异的结合总是会发生的.
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6楼2013-06-08 18:27:09
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liujun1102

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-06-08 18:27:09
需要, 因为不管怎么洗脱, 非特异的结合总是会发生的.

那加内参还用做input吗？还是input也得加内参？
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7楼2013-06-09 10:45:33
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
需要的,内参在各种样品里面的作用就是确定其他DNA片段的相对含量. 不同的样品之间只有知道了内参的量才能比较其他的序列的含量高低. 不做input是可以的, 那么对照样品就换成IgG或者一个完全不相干的抗体,  我个人的看法是input对照不如IgG对照好, 因为在超声过后的抗体结合, 洗脱, 纯化时你不知道会不会有什么无法预料因素影响最后的富集结果, 而这些实验差异在input里面是体现不出来的.
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8楼2013-06-09 20:26:51
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