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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 最近做western blot 遇到问题，请各路大神指教
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gg880712

新虫 (初入文坛)

[求助] 最近做western blot 遇到问题，请各路大神指教 已有2人参与

小的做一个外泌蛋白的western，用flag标签标记了这个蛋白，目的大小预测为71KD，如果去掉信号肽的话也有69KD，但杂交总得到两条条带，一条是70KD左右的目的条带，另一条大概60KD左右，甚至条带比目的条带还要深，感觉不像杂带。
        请问大神们这是怎么一回事？会不会和信号肽有关系？会不会和蛋白构象有关系？
        坐等指教啊！

最近做western blot 遇到问题，请各路大神指教
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1楼 2014-05-05 11:02:45
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gg880712

新虫 (初入文坛)
有没有人帮帮我啊。。。
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2楼2014-05-07 10:11:57
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是用Flag，也有多带。用多克隆抗体的时候还有比目的带强的杂带，多克隆抗体也会有杂带。
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3楼2014-05-08 09:18:29
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-08 09:18:29
我也是用Flag，也有多带。用多克隆抗体的时候还有比目的带强的杂带，多克隆抗体也会有杂带。

就是说有杂带是正常现象？
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4楼2014-05-08 10:45:04
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gg880712: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-05-08 12:31:54
有杂带是正常情况
尤其是你自己制作的抗体，更是如此。
但是你的图显示那个应该不是杂带，因为你的其他背景比较干净。
可能情况是，该基因是否只有一种剪切表达形式？
另外，你用大胶跑一下，你的条带分的不是太明显
最后，如果条件允许，做个双向电泳看看到底是啥情况，说不定是个新发现
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天行健
5楼2014-05-08 10:54:38
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-05-08 10:54:38
有杂带是正常情况
尤其是你自己制作的抗体，更是如此。
但是你的图显示那个应该不是杂带，因为你的其他背景比较干净。
可能情况是，该基因是否只有一种剪切表达形式？
另外，你用大胶跑一下，你的条带分的不是太 ...

谢谢啦~我对蛋白了解不多，想请教下什么是蛋白的剪切表达形式？
我这个蛋白是几丁质酶，酶会有不同的剪切表达形式么？
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6楼2014-05-08 12:31:07
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主
引用回帖:
6楼: Originally posted by gg880712 at 2014-05-08 12:31:07
谢谢啦~我对蛋白了解不多，想请教下什么是蛋白的剪切表达形式？
我这个蛋白是几丁质酶，酶会有不同的剪切表达形式么？...

剪切是RNA剪切，一个基因可能会有多个表达蛋白，比如某个外显子子被剪切掉或者内含子保留等，从而翻译出来的蛋白发生改变。
酶可能存在不同的异构体
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天行健
7楼2014-05-08 14:33:50
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-05-08 14:33:50
剪切是RNA剪切，一个基因可能会有多个表达蛋白，比如某个外显子子被剪切掉或者内含子保留等，从而翻译出来的蛋白发生改变。
酶可能存在不同的异构体...

嗯 我这个是细菌里的，所以应该不存在内含子啥的了。
如果有异构体的话，western上样前蛋白不是都煮了？
煮了以后所有结构应该都破坏了吧？
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8楼2014-05-08 14:54:11
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gg880712 at 2014-05-08 10:45:04
就是说有杂带是正常现象？...

Yes
9楼2014-05-08 18:38:47
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