应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了
81/1返回列表
查看: 1659  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

?木木@

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了 已有4人参与

做两个酶的克隆表达，克隆，测序，都没问题，
然后设表达引物，用的Pet28a，酶切位点：1号 （ NCO1 和Xho1 ）  2号 （Nhe1和Xho1）
双酶切，验证，（两个酶都是2500多bp），条带位置正确，载体条带也正确（单酶切实验过，都能切开）

然后：问题来了，就做链接，还做了3种比例的链接，用BL21感受态，
挑菌，菌落PCR，要是没连上吧，应该是250bp的一段，要是连上了，应该就是和我的目的片段2500差不多，
可是，条带偏偏是2000不到，去测序 ，结果是：结果显示，测序没有信号或信号微弱，测序结果不可用，我们将终止此反应。建议您重新检测模板和（或）更换引物后，重新测序。

这怎么回事啊，我2500的条带放进去连接，怎么连出来的不是目的条带，里面就：双酶切后的目的基因，28a，T4buffer，T4酶，就没有了啊

附图，分别是第一个和第二个的菌落PCR，通用引物扩的

跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了
222.jpg


跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了-1
111111.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-20 19:19:59
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BioChen

银虫 (正式写手)
兄弟拜错神了，你的问题不是PCR大神能解决的，你的PCR做的很好嘛
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-20 19:45:54
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:49
一般是用JM109和DH5alpha做克隆的宿主，然后测序验证，正确的克隆子提取后再转化BL21。你不妨试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-20 22:33:51
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:52
可能是通用引物和你基因内部的非特异性扩增，可以用你扩增基因用的引物再做一次菌落PCR，或者直接提质粒双酶切验证。
送测序最好用质粒测序，也可以准备1ml的菌液一起装到测序袋里备测。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2014-05-21 00:16:30
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meng_xu

铜虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:57
PCR没有问题，你的序列中有很多重复片段么？如果有，建议用DH5a或者DH10B做转化，然后再转BL21看表达
赞一下 回复此楼
5楼2014-05-21 06:06:19
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一城烟雨朦胧

新虫 (初入文坛)
看看目的基因上的酶切位点是不是都只有一个，我也不是很懂……

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-05-22 22:14:03
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangxh1234

银虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好做重组质粒的双酶切验证一下，测序没结果也可能是污染的问题，实在不行用真实重组子重新转化一次
赞一下 回复此楼
7楼2014-05-22 22:26:15
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuefeng506

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
由于基因组DNA的影响，菌落PCR有些时候并不可靠。挑几个转化子，提质粒做下测序和双酶切比较靠谱。
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-23 10:10:16
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ?木木@ 的主题更新
81/1返回列表
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 070300化学学硕求调剂 +5 太想进步了0608 2026-03-16 5/250 2026-03-16 14:11 by xwxstudy
[考研] 304求调剂 +6 小熊joy 2026-03-14 6/300 2026-03-16 12:59 by Iveryant
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +9 不知道叫什么！ 2026-03-15 10/500 2026-03-16 10:04 by houyaoxu
[硕博家园] 深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿） +4 xujiaoszu 2026-03-11 8/400 2026-03-16 09:45 by xujiaoszu
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 0703化学调剂，求各位老师收留 +7 秋有木北 2026-03-14 7/350 2026-03-15 17:30 by 小物理化学
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 290求调剂 +4 @将就将就看 2026-03-10 8/400 2026-03-14 14:23 by 千千运气
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-10 11/550 2026-03-14 12:18 by 邱gl
[考研] 333求调剂 +3 球球古力 2026-03-09 3/150 2026-03-14 01:57 by JourneyLucky
[考研] 0703求调剂 +7 jtyq001 2026-03-10 7/350 2026-03-14 01:06 by JourneyLucky
[考研] 招收0805（材料）调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 279求调剂 +3 Dizzy123@ 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:02 by JourneyLucky
[考研] 336求调剂 +6 Iuruoh 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:06 by JourneyLucky
[考研] 333求调剂 +3 球球古力 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:27 by JourneyLucky
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 求调剂 资源与环境 285 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:31 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭