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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了
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?木木@

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了 已有4人参与

做两个酶的克隆表达，克隆，测序，都没问题，
然后设表达引物，用的Pet28a，酶切位点：1号 （ NCO1 和Xho1 ）  2号 （Nhe1和Xho1）
双酶切，验证，（两个酶都是2500多bp），条带位置正确，载体条带也正确（单酶切实验过，都能切开）

然后：问题来了，就做链接，还做了3种比例的链接，用BL21感受态，
挑菌，菌落PCR，要是没连上吧，应该是250bp的一段，要是连上了，应该就是和我的目的片段2500差不多，
可是，条带偏偏是2000不到，去测序 ，结果是：结果显示，测序没有信号或信号微弱，测序结果不可用，我们将终止此反应。建议您重新检测模板和（或）更换引物后，重新测序。

这怎么回事啊，我2500的条带放进去连接，怎么连出来的不是目的条带，里面就：双酶切后的目的基因，28a，T4buffer，T4酶，就没有了啊

附图，分别是第一个和第二个的菌落PCR，通用引物扩的

跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了
222.jpg


跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了-1
111111.jpg
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1楼 2014-05-20 19:19:59
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BioChen

银虫 (正式写手)
兄弟拜错神了，你的问题不是PCR大神能解决的，你的PCR做的很好嘛
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2楼2014-05-20 19:45:54
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:49
一般是用JM109和DH5alpha做克隆的宿主，然后测序验证，正确的克隆子提取后再转化BL21。你不妨试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-05-20 22:33:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:52
可能是通用引物和你基因内部的非特异性扩增，可以用你扩增基因用的引物再做一次菌落PCR，或者直接提质粒双酶切验证。
送测序最好用质粒测序，也可以准备1ml的菌液一起装到测序袋里备测。
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大家相互帮助哈
4楼2014-05-21 00:16:30
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-22 15:57:57
PCR没有问题，你的序列中有很多重复片段么？如果有，建议用DH5a或者DH10B做转化，然后再转BL21看表达
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5楼2014-05-21 06:06:19
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一城烟雨朦胧

新虫 (初入文坛)
看看目的基因上的酶切位点是不是都只有一个，我也不是很懂……

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-05-22 22:14:03
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wangxh1234

银虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好做重组质粒的双酶切验证一下，测序没结果也可能是污染的问题，实在不行用真实重组子重新转化一次
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7楼2014-05-22 22:26:15
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yuefeng506

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
由于基因组DNA的影响，菌落PCR有些时候并不可靠。挑几个转化子，提质粒做下测序和双酶切比较靠谱。
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8楼2014-05-23 10:10:16
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