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新虫 (初入文坛)

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虫号: 2003363
注册: 2012-09-15
专业: 微生物遗传育种学

[求助] 跪求PCR大神，解决小弟问题，都一个多月了，快被折腾死了已有4人参与

做两个酶的克隆表达，克隆，测序，都没问题，
然后设表达引物，用的Pet28a，酶切位点：1号（ NCO1 和Xho1 ） 2号（Nhe1和Xho1）
双酶切，验证，（两个酶都是2500多bp），条带位置正确，载体条带也正确（单酶切实验过，都能切开）

然后：问题来了，就做链接，还做了3种比例的链接，用BL21感受态，
挑菌，菌落PCR，要是没连上吧，应该是250bp的一段，要是连上了，应该就是和我的目的片段2500差不多，
可是，条带偏偏是2000不到，去测序，结果是：结果显示，测序没有信号或信号微弱，测序结果不可用，我们将终止此反应。建议您重新检测模板和（或）更换引物后，重新测序。

这怎么回事啊，我2500的条带放进去连接，怎么连出来的不是目的条带，里面就：双酶切后的目的基因，28a，T4buffer，T4酶，就没有了啊

附图，分别是第一个和第二个的菌落PCR，通用引物扩的

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