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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大神--关于PCR的问题

最近设计了一对引物扩增一段序列，用质粒做的模板，目的条带3000bp左右，扩增条件：95 5min;35循环（95 30s--60 30s---72  1min）; 72  7min .
第一次扩增用“r Taq酶”，结果是图1，稀释100倍的扩增成功，稀释1000倍的只有一个扩出来，但都含有其他的杂带。第二次扩增用“r Taq酶和exTaq酶”同时扩增，模板添加量分别是1微升（图2）和2微升（图3），结果1微升的扩增条带比2微升的要亮，另外，exTaq酶不但没有扩增出来目的条带（仅仅在稀释1000倍的1微升中有一个）反而杂条带扩增比较亮，这是什么原因呢？

求各位大神指导~~~~

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1楼2013-04-01 21:03:30
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-02 08:51:25
Cheryl1117: 金币+1, ★有帮助 2013-04-02 19:40:01
的确好诡异！不过模板浓度不能太大，太浓反而得不到结果，Ex-Taq的保真性，特异性都比较高，可能你的基因片段或引物本身的问题吧……你还可以优化下温度……
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To be strong enough
2楼2013-04-01 21:23:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。鼓励应助 2013-04-02 08:50:56
Cheryl1117: 金币+1, ★有帮助 2013-04-02 19:40:08
PCR做35循环的情况下PCR检测产物时已经达到饱和，终产物的浓度不能完全反映模板浓度。此外，你说的1微升模板比2微升的亮，需要在一块胶上比较。有杂带说明是引物特异性不高或者PCR条件未达到最优。你可以试试优化退火温度。此外，扩增3kb片段，对taq酶来说，每个循环的延伸时间应该为3分钟。不同的聚合酶的最适条件可能会有一定差别，需要分别做优化。
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3楼2013-04-01 23:49:36
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-02 08:50:35
1，又杂带说明引物的特异性不是很好，可提高退火温度
2，不同的扩增酶效率不一样，有些保真性好的酶扩增效率往往会低一点
3，你的目的条带是3kbp，三步循环中72度延伸3min，1000bp/min
4，模板浓度太高是会抑制PCR的扩增效率的，所以不是模板量越多越好，反之太低也是会降低扩增效率的
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生物化学与分子生物学
4楼2013-04-02 08:36:50
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
延伸时间短了点吧 我不太清楚你说的这两种酶的延伸效率怎么样 我们用Trans金的像3000的条带要2.5分钟
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5楼2013-04-02 09:55:53
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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by alice at 2013-04-01 21:23:22
的确好诡异！不过模板浓度不能太大，太浓反而得不到结果，Ex-Taq的保真性，特异性都比较高，可能你的基因片段或引物本身的问题吧……你还可以优化下温度……

退火温度优化过，58、60、62 都做过，但只有60能P出来。
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6楼2013-04-02 19:32:27
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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-01 23:49:36
PCR做35循环的情况下PCR检测产物时已经达到饱和，终产物的浓度不能完全反映模板浓度。此外，你说的1微升模板比2微升的亮，需要在一块胶上比较。有杂带说明是引物特异性不高或者PCR条件未达到最优。你可以试试优化退 ...

延伸3分钟的也做过，可是没有结果
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7楼2013-04-02 19:34:24
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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Cheryl1117 at 2013-04-02 19:34:24
延伸3分钟的也做过，可是没有结果...

这是延伸3min的图片

PEPC PCR EXTAQ 3.30（1）.jpg



PEPC PCR RTAQ 3.30（1）.jpg
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8楼2013-04-02 21:47:43
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eiieen

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-26 21:16:30
我们做过以质粒为模板，目的片段长度5000bp。
所以按你的3000bp目的条带来建议：
1,  95度2:30分钟预变性，时间过长会增加杂带
2,  72度延伸时间3:10分钟
3，质粒测测浓度，稀释至20ng~100ng即可，这样的PCR产物跑出来的电泳没有原模板的杂带。
4，跑电泳的时候加一个对照：作为模板的质粒500纳克-1微克
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9楼2013-04-03 09:10:32
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susan小水

铁虫 (初入文坛)
你的引物太多了吧，前面那一排模模糊糊的是什么  是引物带吧  若是的话，引物实在加的太多了  都跑出来了
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原谅我一生，放纵不羁爱自由
10楼2013-08-14 21:00:34
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