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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大神--关于PCR的问题

最近设计了一对引物扩增一段序列,用质粒做的模板,目的条带3000bp左右,扩增条件:95 5min;35循环(95 30s--60 30s---72  1min); 72  7min .
第一次扩增用“r Taq酶”,结果是图1,稀释100倍的扩增成功,稀释1000倍的只有一个扩出来,但都含有其他的杂带。第二次扩增用“r Taq酶和exTaq酶”同时扩增,模板添加量分别是1微升(图2)和2微升(图3),结果1微升的扩增条带比2微升的要亮,另外,exTaq酶不但没有扩增出来目的条带(仅仅在稀释1000倍的1微升中有一个)反而杂条带扩增比较亮,这是什么原因呢?

求各位大神指导~~~~

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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助,分子生物版块,期待你的精彩。 2013-04-02 08:50:35
1,又杂带说明引物的特异性不是很好,可提高退火温度
2,不同的扩增酶效率不一样,有些保真性好的酶扩增效率往往会低一点
3,你的目的条带是3kbp,三步循环中72度延伸3min,1000bp/min
4,模板浓度太高是会抑制PCR的扩增效率的,所以不是模板量越多越好,反之太低也是会降低扩增效率的
生物化学与分子生物学
4楼2013-04-02 08:36:50
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