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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教关于PCR的问题！！！
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ottolzm

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于PCR的问题！！！ 已有9人参与

最近做了一下PCR 发现自己的PCR没有结果 想寻求以下原因 是引物的问题 还是模板的问题  原先的引物为21bp  15bp  (没加酶切位点)，21bp  19bp (没加酶切位点) 这样的酶切位点是不是太短了  用不用再加长点（待扩增片段 第一段长 798bp  第二段 831bp）还有我现在用的是BBI 公司的Taq DNA polymerase 模板量为 0.5 微升 做了一次 扩增出来的是1500bp 的条带  加到1微升的时候 没有扩增出来  实验室有人建议加到3微升试试 不知道坛子里的各位大侠能否帮帮忙 优化一下反应条件。小弟在此 谢谢各位！！！
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1楼 2010-05-24 09:05:49
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~~ 2010-05-24 12:17:02
引物长度不是关键，主要看tm值，是否有二级结构等，

扩出来1500bp应该是非特异性扩增产物，所以可以提高引物tm值，
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2楼2010-05-24 11:03:06
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶的量0.5已经够用了，主要还是PCR退火温度
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3楼2010-05-24 11:18:08
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ottolzm

木虫 (正式写手)
呵呵 谢谢 楼上的两位大侠  我已经做了温度梯度  在50度的时候 非特异性条带很多 也包括我想要的 但是当我的Tm调节到68度的时候 什么都没有 (引物带酶切位点的Tm为69.8 而不带酶切位点的Tm为64.7)  请教一下各位大侠 能否在提高退火温度 还是 重新设计引物？
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4楼2010-05-25 08:45:26
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dujing19841014

铁虫 (小有名气)
★
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-25 15:23:55
主要是退火温度，你可以在50度左右在做梯度试试，还有就是循环数，你可以在增加一些。
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5楼2010-05-25 11:37:43
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天逸生命

新虫 (初入文坛)

PCR梯度的温度设置后，是不是温度越高特异性越强

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
谢谢牛人的帮助
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6楼2010-05-25 21:50:57
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lzf0411

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
延伸时间不要太长
还是要提一下退火温度
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7楼2010-05-25 22:41:23
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nklyw

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还是改变一下退火温度吧
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8楼2010-05-25 23:10:07
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ottolzm

木虫 (正式写手)
谢谢楼上的各位大侠和好心人
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9楼2010-05-26 14:25:36
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zhmy26

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
既然你已经可以克隆出来多条非特异性条带，其中包括你所需要的。那就将你需要的条带纯化出来，作为模板，重新PCR不就行了？
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10楼2010-05-26 15:42:56
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