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yeedro铁杆木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】向各位大虾请教“易错PCR” 已有4人参与
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第一次做“易错PCR”，问题可能有些幼稚，请别见笑。 主要是，在做镁离子调节时，以怎么个梯度来进行比较好呢？0.5mmol逐渐增加，还是怎样呢？ 关于这种PCR方法，大家有什么好的建议吗？最需要注意什么呢？ |
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姜大磊
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我了解也不多，google了下，嘿嘿~ http://bbs.bbioo.com/thread-56842-1-1.html 易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件， 如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度 DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随 机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。其关键在于对合适突变频率的选择， 突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太 低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖 于突变的DNA片段的长度。通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此 发展出连续易错 PCR(sequentialermr-PronePCR)策略。即将一次扩增得到的有益突 变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正 向突变累积而产生重要的有益突变。由于易错PCR涉及的遗传变化只发生在单一 分子内部，故属于无性进化 (asexualevolution)。它虽然可以有效的产生突变，且操 作方法简单，但其一般只适用较小的基因片段，且突变碱基中转换高于颠换，应用 范围较为有限。 |
5楼2011-04-21 11:50:56