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Cheryl1117

新虫 (初入文坛)

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[求助] 求助各位大神--关于PCR的问题

最近设计了一对引物扩增一段序列，用质粒做的模板，目的条带3000bp左右，扩增条件：95 5min;35循环（95 30s--60 30s---72 1min）; 72 7min .
第一次扩增用“r Taq酶”，结果是图1，稀释100倍的扩增成功，稀释1000倍的只有一个扩出来，但都含有其他的杂带。第二次扩增用“r Taq酶和exTaq酶”同时扩增，模板添加量分别是1微升（图2）和2微升（图3），结果1微升的扩增条带比2微升的要亮，另外，exTaq酶不但没有扩增出来目的条带（仅仅在稀释1000倍的1微升中有一个）反而杂条带扩增比较亮，这是什么原因呢？

求各位大神指导~~~~

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1楼 2013-04-01 21:03:30

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。鼓励应助 2013-04-02 08:50:56
Cheryl1117: 金币+1, ★有帮助 2013-04-02 19:40:08

PCR做35循环的情况下PCR检测产物时已经达到饱和，终产物的浓度不能完全反映模板浓度。此外，你说的1微升模板比2微升的亮，需要在一块胶上比较。有杂带说明是引物特异性不高或者PCR条件未达到最优。你可以试试优化退火温度。此外，扩增3kb片段，对taq酶来说，每个循环的延伸时间应该为3分钟。不同的聚合酶的最适条件可能会有一定差别，需要分别做优化。