应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助各位大神--关于PCR的问题
51/1返回列表
查看: 1652  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Cheryl1117

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大神--关于PCR的问题

最近设计了一对引物扩增一段序列，用质粒做的模板，目的条带3000bp左右，扩增条件：95 5min;35循环（95 30s--60 30s---72  1min）; 72  7min .
第一次扩增用“r Taq酶”，结果是图1，稀释100倍的扩增成功，稀释1000倍的只有一个扩出来，但都含有其他的杂带。第二次扩增用“r Taq酶和exTaq酶”同时扩增，模板添加量分别是1微升（图2）和2微升（图3），结果1微升的扩增条带比2微升的要亮，另外，exTaq酶不但没有扩增出来目的条带（仅仅在稀释1000倍的1微升中有一个）反而杂条带扩增比较亮，这是什么原因呢？

求各位大神指导~~~~

1.jpg



2.jpg



3.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-04-01 21:03:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Cheryl1117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-01 23:49:36
PCR做35循环的情况下PCR检测产物时已经达到饱和，终产物的浓度不能完全反映模板浓度。此外，你说的1微升模板比2微升的亮，需要在一块胶上比较。有杂带说明是引物特异性不高或者PCR条件未达到最优。你可以试试优化退 ...

延伸3分钟的也做过，可是没有结果
赞一下 回复此楼
7楼2013-04-02 19:34:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

alice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-02 08:51:25
Cheryl1117: 金币+1, ★有帮助 2013-04-02 19:40:01
的确好诡异！不过模板浓度不能太大，太浓反而得不到结果，Ex-Taq的保真性，特异性都比较高，可能你的基因片段或引物本身的问题吧……你还可以优化下温度……
赞一下 回复此楼
To be strong enough
2楼2013-04-01 21:23:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。鼓励应助 2013-04-02 08:50:56
Cheryl1117: 金币+1, ★有帮助 2013-04-02 19:40:08
PCR做35循环的情况下PCR检测产物时已经达到饱和，终产物的浓度不能完全反映模板浓度。此外，你说的1微升模板比2微升的亮，需要在一块胶上比较。有杂带说明是引物特异性不高或者PCR条件未达到最优。你可以试试优化退火温度。此外，扩增3kb片段，对taq酶来说，每个循环的延伸时间应该为3分钟。不同的聚合酶的最适条件可能会有一定差别，需要分别做优化。
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-01 23:49:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-02 08:50:35
1，又杂带说明引物的特异性不是很好，可提高退火温度
2，不同的扩增酶效率不一样，有些保真性好的酶扩增效率往往会低一点
3，你的目的条带是3kbp，三步循环中72度延伸3min，1000bp/min
4，模板浓度太高是会抑制PCR的扩增效率的，所以不是模板量越多越好，反之太低也是会降低扩增效率的
赞一下(1人) 回复此楼
生物化学与分子生物学
4楼2013-04-02 08:36:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 297求调剂 +16 ljy20040718！ 2026-04-03 18/900 2026-04-09 17:24 by 5268321
[考研] 0854调剂 +8 长弓傲 2026-04-09 9/450 2026-04-09 14:37 by zhyzzh
[考研] 化学调剂求助 +14 LULONG1 2026-04-03 19/950 2026-04-09 10:43 by chenxi233
[考研] 考研求调剂 +4 雯??? 2026-04-08 4/200 2026-04-08 21:44 by 土木硕士招生
[考研] 318求调剂 +13 ykyhsa 2026-04-05 15/750 2026-04-08 21:37 by wj165256
[考研] 283求调剂 +19 A child 2026-04-04 19/950 2026-04-08 14:26 by xingguangj
[考研] 材料专硕 调剂 +17 CXN123456 2026-04-03 17/850 2026-04-08 11:10 by lijunpoly
[考研] 336材料与化工085600求调剂 +19 水星记infp 2026-04-05 22/1100 2026-04-07 21:11 by yongzhesheng
[考研] 307求调剂 +3 所念及所望 2026-04-06 3/150 2026-04-06 17:30 by 土木硕士招生
[考研] 一志愿南航，数一英一学硕317求调剂！！ +6 Acaciad 2026-04-04 6/300 2026-04-06 12:13 by 考研学校招点人
[考研] 一志愿 江南大学 085602 化工专硕 338分求调剂 +15 路痴小琪 2026-04-05 15/750 2026-04-06 09:27 by cql1109
[考研] 0703求调剂383分 +9 W55j 2026-04-03 9/450 2026-04-06 06:50 by houyaoxu
[考研] 22408 总分320，一篇论文二作，两个国三，求调剂 +3 Leomulufu 2026-04-04 5/250 2026-04-05 19:04 by chongya
[考研] 男生，一志愿沪9生物学071000，初试308求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-04 3/150 2026-04-05 08:26 by barlinike
[考研] 290求调剂 +7 luoziheng 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:17 by lqwchd
[考研] 283分求调剂 +7 小聂爱学习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 21:51 by hemengdong
[考研] [调剂信息]085408光电信息 求调剂 总分291分数一英一 +3 iz11az 2026-04-02 3/150 2026-04-04 19:09 by 蓝云思雨
[考研] 317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂 +6 YinTai 2026-04-03 6/300 2026-04-03 22:30 by 无际的草原
[考研] 求调剂 +4 压力??大 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:36 by 啵啵啵0119
[考研] 调剂 +5 asdasdassda 2026-04-03 6/300 2026-04-03 20:27 by 岸上的一条鱼
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭