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gu666hong

银虫 (小有名气)

[求助] Ecor Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切结果,目的条带有,可是另一条带比原来质粒还要大,怎么解释呢 已有1人参与

双酶切结果,切出来比原质粒还要大的条带,不明白,求解释

我的加样顺序依次1-8是Marker 5000,TE原质粒,TE酶切结果,TF原质粒,TF酶切结果,ED3质粒,ED3酶切结果,ED3酶切结果

Ecor Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切结果,目的条带有,可是另一条带比原来质粒还要大,怎么解释呢
Administrator 2014-05-16 15hr 52min.jpg
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-16 18:08:45
这种情况是因为,一般抽提的质粒有三种构象,线性,开环,超螺旋(超螺旋的越多,质粒质量越好),虽然他们的分子量一样,但是在琼脂糖胶的泳动速度不同,由快到慢分别为:超螺旋>线性>开环

你的质粒用EcoRⅠ ...

那我这酶切算成功的么,
我原质粒单酶切以后和这个比较可以看出来。
我的问题为什么我的目的条带这么微弱呢,想回收目的片段的话 怎么办呢,我想的是加长酶切时间,之前我是酶切了2个小时。不知道对不对呢?
3楼2014-05-16 21:11:14
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-16 20:47:33
这种情况是因为,一般抽提的质粒有三种构象,线性,开环,超螺旋(超螺旋的越多,质粒质量越好),虽然他们的分子量一样,但是在琼脂糖胶的泳动速度不同,由快到慢分别为:超螺旋>线性>开环

你的质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切,虽然有目的条带,但是很小,大条带被线性化后即使减去这一小段序列,电泳泳动速度还是比超螺旋的慢,所以得到,另一条带比原来质粒还要大

看质粒大小时,将质粒单酶切线性化后电泳然后和marker进行比较才有意义
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-16 18:08:45
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
gu666hong: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-05-17 09:22:43
引用回帖:
3楼: Originally posted by gu666hong at 2014-05-16 21:11:14
那我这酶切算成功的么,
我原质粒单酶切以后和这个比较可以看出来。
我的问题为什么我的目的条带这么微弱呢,想回收目的片段的话 怎么办呢,我想的是加长酶切时间,之前我是酶切了2个小时。不知道对不对呢?...

你这个切的没有问题,目的片段比较微弱是因为片段比较小,所以总的DNA质量比较小,结合EB燃料少,所以染不亮,要获得更多的目的片段,需要加大酶切载体的量而不是酶切时间
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-05-16 21:18:13
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-16 21:18:13
你这个切的没有问题,目的片段比较微弱是因为片段比较小,所以总的DNA质量比较小,结合EB燃料少,所以染不亮,要获得更多的目的片段,需要加大酶切载体的量而不是酶切时间...

好的,谢谢啦
5楼2014-05-17 09:23:24
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