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gu666hong

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[求助] Ecor Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切结果，目的条带有，可是另一条带比原来质粒还要大，怎么解释呢已有1人参与

双酶切结果，切出来比原质粒还要大的条带，不明白，求解释

我的加样顺序依次1-8是Marker 5000,TE原质粒，TE酶切结果，TF原质粒，TF酶切结果，ED3质粒，ED3酶切结果，ED3酶切结果

Administrator 2014-05-16 15hr 52min.jpg

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1楼 2014-05-16 17:18:42

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gu666hong

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引用回帖:

2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-16 18:08:45
这种情况是因为，一般抽提的质粒有三种构象，线性，开环，超螺旋(超螺旋的越多，质粒质量越好)，虽然他们的分子量一样，但是在琼脂糖胶的泳动速度不同，由快到慢分别为：超螺旋>线性>开环

你的质粒用EcoRⅠ ...

那我这酶切算成功的么，
我原质粒单酶切以后和这个比较可以看出来。
我的问题为什么我的目的条带这么微弱呢，想回收目的片段的话怎么办呢，我想的是加长酶切时间，之前我是酶切了2个小时。不知道对不对呢？

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3楼2014-05-16 21:11:14

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gyesang

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-16 20:47:33

这种情况是因为，一般抽提的质粒有三种构象，线性，开环，超螺旋(超螺旋的越多，质粒质量越好)，虽然他们的分子量一样，但是在琼脂糖胶的泳动速度不同，由快到慢分别为：超螺旋>线性>开环

你的质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，虽然有目的条带，但是很小，大条带被线性化后即使减去这一小段序列，电泳泳动速度还是比超螺旋的慢，所以得到，另一条带比原来质粒还要大

看质粒大小时，将质粒单酶切线性化后电泳然后和marker进行比较才有意义

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2楼2014-05-16 18:08:45

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【答案】应助回帖

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gu666hong: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-05-17 09:22:43

引用回帖:

3楼: Originally posted by gu666hong at 2014-05-16 21:11:14
那我这酶切算成功的么，
我原质粒单酶切以后和这个比较可以看出来。
我的问题为什么我的目的条带这么微弱呢，想回收目的片段的话怎么办呢，我想的是加长酶切时间，之前我是酶切了2个小时。不知道对不对呢？...

你这个切的没有问题，目的片段比较微弱是因为片段比较小，所以总的DNA质量比较小，结合EB燃料少，所以染不亮，要获得更多的目的片段，需要加大酶切载体的量而不是酶切时间

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4楼2014-05-16 21:18:13

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