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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 最近做pcr,内参出来了,目的片段却一直出不来,只有引物二聚体 已有7人参与

最近做pcr,内参出来了,目的片段却一直出不来,只有引物二聚体。
其中很亮的三个是内参,从右到左依此是四个不同引物,跑了三个平行,可是全都是引物二聚体。
反应程序:94℃  5min
                 94℃   50s
                 52℃   1min      
                 72℃   1.5min     35cycles
                 72℃   10min
                  8℃   
    目的片段长度: 右一:678bp, 右二:1261bp,右三:1514bp,右四:425bp.
   PS:引物是老师帮忙设计的,应该没什么问题,可就是跑不出来。老师也帮忙优化了一次体系,还是没出来。
还有模板用内参跑出来很亮,有没有可能是模板的问题?
  求各位大侠给个建议。

最近做pcr,内参出来了,目的片段却一直出不来,只有引物二聚体
dell 2014-04-30 15 时 46 分.jpg
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
dingcong1216(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:36
引物设计有没有问题?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-04-30 18:30:26
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

胶放反了!!!引物可能需要重新设计了
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
3楼2014-04-30 20:08:18
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dingcong1216(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:50
DNA 模板应该没有问题,你的control可以P出来
那就是你引物设计的问题了吧,还有,你的退火条件,是按照你设计引物的退火温度,还是就是设定在52呢?

如果不行,可以尝试touch down,或者,在反应体系中加3%的DMSO看看。
4楼2014-05-01 08:11:23
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:58
你如何确认你要测的基因表达?

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-05-01 16:02:07
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liuheys

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我同意楼上那位同学的。曾经一个师妹做PCR总是引物二聚,加了点DMSO就好了。
6楼2014-05-03 21:06:32
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wangxh1234

银虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

重新合成或设计引物试试看
7楼2014-05-03 21:27:03
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香! 2014-05-03 23:28:25
用touch down试试吧,我以前扩一个不怎么好扩的基因就是用它扩出来的

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-05-03 23:14:37
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zix1

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


dingcong1216(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-05 12:15:00
可能退火温度太低了还和时间太长了吧,引物间错配了,尝试改善pcr条件和热启动试下。

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-05-03 23:53:51
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dingcong1216

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-01 08:11:23
DNA 模板应该没有问题,你的control可以P出来
那就是你引物设计的问题了吧,还有,你的退火条件,是按照你设计引物的退火温度,还是就是设定在52呢?

如果不行,可以尝试touch down,或者,在反应体系中加3%的D ...

嗯,退火温度我用的梯度的都没有出来,老师帮我看了一下,说52差不多可以了。还有我之前想过用touch down,可是我们的是的effdorf的普通的PCR仪,不知道你能不能设定touch down的程序。
10楼2014-05-04 10:07:02
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