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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

[求助] 全长cDNA PCR问题 已有1人参与

最近做了RT,然后做全长cDNA的PCR,但是一直P不出东西来,跑胶只能看到引物二聚化的条带。
PCR有做了内参基因,能够P出来。
请问这是什么原因呢??

我P的是FBXO32,引物(加了酶切位点和保护碱基)如下:
FP:  ATA GCGGCCGC A ATGCCATTCCTCGGGCAGGA      67℃
RP:  GGCGCGCC C GCAGAACTTGAACAAGTTGATAAAGTCC   63℃
Tm值是不计算酶切位点和保护碱基序列的值。

求大神指点!!
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-27 11:21:01
ashleyoo00: 金币+2, 有帮助 2014-04-28 19:40:08
你这算法不大对啊,再说了,你两条引物也差得太多了,难p是很正常的

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-04-26 22:42:15
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-26 22:42:15
你这算法不大对啊,再说了,你两条引物也差得太多了,难p是很正常的

用Primer Premier 5设计引物软件自己计算的Tm值呀,然后这段CDS两端的GC含量本身相差也较大,为了保证两条引物的退火温度比较接近,所以它们的长度也就相差比较大了。这个有什么解决办法吗??引物的设计我也不是很懂,求救><
3楼2014-04-26 22:49:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-27 11:21:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by ashleyoo00 at 2014-04-26 22:49:25
用Primer Premier 5设计引物软件自己计算的Tm值呀,然后这段CDS两端的GC含量本身相差也较大,为了保证两条引物的退火温度比较接近,所以它们的长度也就相差比较大了。这个有什么解决办法吗??引物的设计我也不是很 ...

那个软件很过时了,建议用primer-blast

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-04-27 08:49:03
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-27 08:49:03
那个软件很过时了,建议用primer-blast
...

用NCBI上的primer-blast吗?那样跟用这个软件有区别么?还有就是这段序列本身前后端的GC含量相差比较大啊。。
5楼2014-04-27 10:54:44
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