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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长cDNA PCR问题
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

[求助] 全长cDNA PCR问题已有1人参与

最近做了RT，然后做全长cDNA的PCR，但是一直P不出东西来，跑胶只能看到引物二聚化的条带。
PCR有做了内参基因，能够P出来。
请问这是什么原因呢？？

我P的是FBXO32，引物（加了酶切位点和保护碱基）如下：
FP:  ATA GCGGCCGC A ATGCCATTCCTCGGGCAGGA      67℃
RP:  GGCGCGCC C GCAGAACTTGAACAAGTTGATAAAGTCC   63℃
Tm值是不计算酶切位点和保护碱基序列的值。

求大神指点！！
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1楼2014-04-26 22:03:24
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-27 11:21:01
ashleyoo00: 金币+2, ★有帮助 2014-04-28 19:40:08
你这算法不大对啊，再说了，你两条引物也差得太多了，难p是很正常的

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2楼2014-04-26 22:42:15
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-26 22:42:15
你这算法不大对啊，再说了，你两条引物也差得太多了，难p是很正常的

用Primer Premier 5设计引物软件自己计算的Tm值呀，然后这段CDS两端的GC含量本身相差也较大，为了保证两条引物的退火温度比较接近，所以它们的长度也就相差比较大了。这个有什么解决办法吗？？引物的设计我也不是很懂，求救><
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3楼2014-04-26 22:49:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-27 11:21:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by ashleyoo00 at 2014-04-26 22:49:25
用Primer Premier 5设计引物软件自己计算的Tm值呀，然后这段CDS两端的GC含量本身相差也较大，为了保证两条引物的退火温度比较接近，所以它们的长度也就相差比较大了。这个有什么解决办法吗？？引物的设计我也不是很 ...

那个软件很过时了，建议用primer-blast

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4楼2014-04-27 08:49:03
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-27 08:49:03
那个软件很过时了，建议用primer-blast
...

用NCBI上的primer-blast吗？那样跟用这个软件有区别么？还有就是这段序列本身前后端的GC含量相差比较大啊。。
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5楼2014-04-27 10:54:44
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