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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 最近做pcr,内参出来了，目的片段却一直出不来，只有引物二聚体
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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 最近做pcr,内参出来了，目的片段却一直出不来，只有引物二聚体 已有7人参与

最近做pcr,内参出来了，目的片段却一直出不来，只有引物二聚体。
其中很亮的三个是内参，从右到左依此是四个不同引物，跑了三个平行，可是全都是引物二聚体。
反应程序：94℃  5min
                 94℃   50s
                 52℃   1min      
                 72℃   1.5min     35cycles
                 72℃   10min
                  8℃   
    目的片段长度： 右一：678bp, 右二：1261bp，右三：1514bp，右四：425bp.
   PS:引物是老师帮忙设计的，应该没什么问题，可就是跑不出来。老师也帮忙优化了一次体系，还是没出来。
还有模板用内参跑出来很亮，有没有可能是模板的问题？
  求各位大侠给个建议。

最近做pcr,内参出来了，目的片段却一直出不来，只有引物二聚体
dell 2014-04-30 15 时 46 分.jpg
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1楼 2014-04-30 16:56:23
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zix1

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
dingcong1216(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-05 12:15:00
可能退火温度太低了还和时间太长了吧，引物间错配了，尝试改善pcr条件和热启动试下。

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-05-03 23:53:51
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
dingcong1216(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:36
引物设计有没有问题？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-04-30 18:30:26
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
胶放反了！！！引物可能需要重新设计了
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
3楼2014-04-30 20:08:18
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dingcong1216(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:50
DNA 模板应该没有问题，你的control可以P出来
那就是你引物设计的问题了吧，还有，你的退火条件，是按照你设计引物的退火温度，还是就是设定在52呢？

如果不行，可以尝试touch down，或者，在反应体系中加3%的DMSO看看。
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4楼2014-05-01 08:11:23
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