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tongyingjia

新虫 (初入文坛)

[求助] 小片段PCR的问题 已有3人参与

我的基因片段长度为324bp,变性温度 94度,30s
                                             退火温度48~58每隔一度设置梯度PCR,30S
                                              延伸温度72度,45s
                                             30个循环
但是PCR结束,跑胶的时候只看到载体的条带,所需要的基因一点都没有p出来,这是为什么呀?求大神解答!!
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tongyingjia: 金币+7, 有帮助 2014-03-17 20:06:35
模板太多了,再一个你设置的梯度最多到58度有点低吧,我们一般是到65度。
hehe
3楼2014-03-12 21:21:00
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tongyingjia(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-12 21:25:58
tongyingjia: 金币+7, 有帮助 2014-03-17 20:06:19
只看到载体的条带?是不是模板加的太多了?

退火温度与用的酶有关,KOD是68,TAQ是72。
2楼2014-03-12 20:52:26
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tongyingjia(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-12 21:26:55
tongyingjia: 金币+4, 有帮助 2014-03-17 20:06:42
(1)载体构建,除了电击转化效率偏低以外,暂时无出现楼主的案例;

(2)最直接的建议:既然PCR效果不理想,换一种验证思路:酶切验证。
4楼2014-03-12 21:24:32
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-12 20:52:26
只看到载体的条带?是不是模板加的太多了?

退火温度与用的酶有关,KOD是68,TAQ是72。

我把模版稀释20倍和稀释200倍都p出来了,但是有很多杂条带,这是怎么回事啊,我的引物都20几bp的,不能再长了吧
5楼2014-03-14 19:24:55
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