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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于PCR中buffer的更换问题
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tawnya

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR中buffer的更换问题

巢式PCR
最开始的时候均用10×Buffer跑PCR，做了很多有极少的条带被扩增出来了
后来换用：第一次PCR用GC Buffer1，第二次仍然用10×Buffer，有一半的条带被扩增出来（相同条件条带明显更加明亮）
今天把没有扩增出的模板拿出来，两次都用GC Buffer1，可以见到影影约约的目的条带

请问这是什么原因？我是不是还要更换GC buffer2试试？需不需要更换引物？
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1楼 2012-03-29 21:47:23
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changes

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tawnya: 金币+3, ★有帮助 2012-04-05 15:55:40
1.普通buffer没有扩增出产物的模板，可能是模板质量不好或浓度不合适。可以重提模板或调整模板浓度。
2.GC buffer2和GC buffer1两种是针对不同模板的吧？
3.引物先不用换，看看最终结果再做决定吧。
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2楼2012-03-29 22:03:35
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tawnya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by changes at 2012-03-29 22:03:35:
1.普通buffer没有扩增出产物的模板，可能是模板质量不好或浓度不合适。可以重提模板或调整模板浓度。
2.GC buffer2和GC buffer1两种是针对不同模板的吧？
3.引物先不用换，看看最终结果再做决定吧。

1.说明书上说的是GC buffer1扩增不出就可以尝试使用GC buffer2
2.模板换过两次，应该没有太大的问题，而且除了换用buffer以外
，我所有的条件都是一样的，所以浓度温度影响可以排除在外。
别人要么就是纯粹跑不出，我这样的跑出一半，而且能够跑出来的这一半跑得还非常好，我还真没有见到有谁这样的。查了好多资料啊都找不出原因。
您的意见是建议我再用现在的引物？那么还需要调整一些什么呢？
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3楼2012-03-29 22:16:17
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
据说GC buffer适用于扩增高GC含量的模板，从楼主的描述，可能扩增所用模板GC含量较高吧。如果1不能成功扩增，可以试试2，PCR条件都是摸索出来的，大胆的试吧。
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4楼2012-03-30 09:00:18
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果模板比较复杂的话，可以尝试用普通buffer再加6%~8%的DMSO，基本上都没有问题，我个人觉得GC buffer不如加DMSO好用，GC buffer可能会引起突变。
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5楼2012-03-30 11:32:53
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real-gold

银虫 (小有名气)
我怎么加DMSO都没效果呢？
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6楼2012-03-30 17:09:06
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.不知道你用的那种酶，我们实验室是LA Tag 酶，其GC buffer适用于高GC含量的pcr扩增
2.也有可能是模板问题
3.试着增加引物浓度，提高退火温度
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7楼2012-03-30 17:19:00
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biosafety

铁杆木虫 (正式写手)
咋看都像是在给Txxxx公司做广告呢？
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科学-哲学-神学-玄学
8楼2012-03-31 04:18:27
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