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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小片段PCR的问题
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)

[求助] 小片段PCR的问题 已有3人参与

我的基因片段长度为324bp，变性温度 94度，30s
                                             退火温度48~58每隔一度设置梯度PCR，30S
                                              延伸温度72度，45s
                                             30个循环
但是PCR结束，跑胶的时候只看到载体的条带，所需要的基因一点都没有p出来，这是为什么呀？求大神解答！！
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1楼 2014-03-12 19:57:54
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tongyingjia(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-12 21:25:58
tongyingjia: 金币+7, ★有帮助 2014-03-17 20:06:19
只看到载体的条带？是不是模板加的太多了？

退火温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。
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2楼2014-03-12 20:52:26
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tongyingjia: 金币+7, ★有帮助 2014-03-17 20:06:35
模板太多了，再一个你设置的梯度最多到58度有点低吧，我们一般是到65度。
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hehe
3楼2014-03-12 21:21:00
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tongyingjia(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-12 21:26:55
tongyingjia: 金币+4, ★有帮助 2014-03-17 20:06:42
（1）载体构建，除了电击转化效率偏低以外，暂时无出现楼主的案例；

（2）最直接的建议：既然PCR效果不理想，换一种验证思路：酶切验证。
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4楼2014-03-12 21:24:32
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-12 20:52:26
只看到载体的条带？是不是模板加的太多了？

退火温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。

我把模版稀释20倍和稀释200倍都p出来了，但是有很多杂条带，这是怎么回事啊，我的引物都20几bp的，不能再长了吧
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5楼2014-03-14 19:24:55
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-12 21:21:00
模板太多了，再一个你设置的梯度最多到58度有点低吧，我们一般是到65度。

恩，我把模版稀释20，200倍都p出来了，但是有很多杂条带，这是为什么呀，我的引物是20几bp的，不能再长了吧
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6楼2014-03-14 19:26:34
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tongyingjia at 2014-03-14 19:24:55
我把模版稀释20倍和稀释200倍都p出来了，但是有很多杂条带，这是怎么回事啊，我的引物都20几bp的，不能再长了吧...

我上面写错了，是延伸温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。
如果这样没有目的条带，可能非特异性太强了。
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7楼2014-03-16 11:40:57
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-16 11:40:57
我上面写错了，是延伸温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。
如果这样没有目的条带，可能非特异性太强了。...

有目的条带，但也有很多杂条带。。。切胶的时候得很小心
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8楼2014-03-17 20:12:30
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by tongyingjia at 2014-03-17 20:12:30
有目的条带，但也有很多杂条带。。。切胶的时候得很小心...

恩   纯化以后以这个为模板再扩
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9楼2014-03-17 20:14:53
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