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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小片段PCR的问题
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)

[求助] 小片段PCR的问题已有3人参与

我的基因片段长度为324bp，变性温度 94度，30s
                                             退火温度48~58每隔一度设置梯度PCR，30S
                                              延伸温度72度，45s
                                             30个循环
但是PCR结束，跑胶的时候只看到载体的条带，所需要的基因一点都没有p出来，这是为什么呀？求大神解答！！
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1楼2014-03-12 19:57:54
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-12 20:52:26
只看到载体的条带？是不是模板加的太多了？

退火温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。

我把模版稀释20倍和稀释200倍都p出来了，但是有很多杂条带，这是怎么回事啊，我的引物都20几bp的，不能再长了吧
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5楼2014-03-14 19:24:55
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-12 21:21:00
模板太多了，再一个你设置的梯度最多到58度有点低吧，我们一般是到65度。

恩，我把模版稀释20，200倍都p出来了，但是有很多杂条带，这是为什么呀，我的引物是20几bp的，不能再长了吧
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6楼2014-03-14 19:26:34
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tongyingjia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-16 11:40:57
我上面写错了，是延伸温度与用的酶有关，KOD是68，TAQ是72。
如果这样没有目的条带，可能非特异性太强了。...

有目的条带，但也有很多杂条带。。。切胶的时候得很小心
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8楼2014-03-17 20:12:30
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