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答案24

木虫 (初入文坛)

高中

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[求助] 求助：内参引物的问题已有1人参与

本人新手，刚刚做荧光半定量，确定内参引物（退火温度是58.4）的循环次数时，用的是混合样品（双平行），做了23 25 28的循环梯度，单独跑电泳。条带是这样的（1）。我就选择了25个循环次数，用六个不同的组织做荧光半定量（前面是目的基因，后六个是内参引物）。出现了内参基因的亮度不恒定，有弱有强（图2），又跑了几次电泳，甚至内参跑不出来（图三）。不知道为什么啊求大侠指点迷津

图2.jpg

图一.jpg

图3.jpg

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认真仔细乐观的对待每一天

1楼 2014-01-02 21:06:26

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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答案24(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-01-03 09:45:06

不同基因的循环数目需要分别摸索，不能只用一个。同一基因，考虑的样品上调和下调的可能，实验时最好采用不同的循环数目，确保所有样品得到理想的扩增。实话说半定量确实有些麻烦，现在荧光定量已经相当普及，最好直接上荧光定量。

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