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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » smd1168毕赤酵母转化问题
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kinshi

铜虫 (小有名气)

[求助] smd1168毕赤酵母转化问题

划板挑单克隆菌落表面光滑，之前转化未线性化的pPIC3.5k后长出来的单克隆也是表面光滑的，后来发现质粒要线性化，结果转入线性化质粒后菌落菌落形态就变了，表面有菌丝状东西，有点像霉菌，但是是有酒香味的，难道转化进质粒后酵母形态发生变化了么？大家有没遇到过，重复2次都这个结果，万分焦急！！！

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1楼 2013-12-22 22:57:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-23 22:23:10
愿把所有金币赠给能解决我这问题的人！刚把转化后的单克隆挑到100微升水里，强烈涡悬后也只溶解了少部分菌，然后菌液镜检，视野下能看到一些球状，但很多是根须状，有时间换台显微镜拍照上传过来
...

你是用多少倍来看的？？如果有根须状那肯定不是酵母，酵母一般是球状或者椭圆状，如果你用100倍镜的话可能还能看到还在进行出芽生殖的酵母。~不会出现什么根须状的情况。
从你上面提到的菌落形态来看，染菌发生在转化这个阶段。~~
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8楼2013-12-24 00:13:34
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普通回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-12-23 08:56:14
kinshi: 金币+10, ★有帮助 2013-12-24 11:42:14
kinshi: 金币+110, ★★★很有帮助, 谢谢你的热情帮助！ 2013-12-26 07:58:34
额，如果有菌丝了那肯定是染菌了啊，酵母的颜色改变没？赶紧去做一个镜检。丝状真菌和酵母菌肯定不一样的~，
如果你做几次都是这个样子的话,可能的原因有：
1.你的出发菌株可能已经染菌了。
2.你转化过程中染的杂菌。如果是电转化最有可能出问题的就是电转化杯，如果实在处理不好就换个试试
3.你的抗性筛选可能有问题。

其实你可以做一个菌落PCR验证一下。如果PCR验证了就直接诱导一次。管他什么形状，关键还是要出蛋白，出活性，如果不出蛋白，没有活性再考虑菌落形态的事情，因为要论证是你的线性化质粒导致菌落形态的改变是一件非常困难的事情。
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2楼2013-12-23 00:48:42
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kinshi

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-23 00:48:42
额，如果有菌丝了那肯定是染菌了啊，酵母的颜色改变没？赶紧去做一个镜检。丝状真菌和酵母菌肯定不一样的~，
如果你做几次都是这个样子的话,可能的原因有：
1.你的出发菌株可能已经染菌了。
2.你转化过程中染的杂 ...

多谢回复！以为是原生菌染菌，重新划板了，转化后开始长出来很小1mm左右的菌表面是光滑的，但是长更大表面就不光滑了。至于表达，主要要筛到多拷贝后再做吧？酵母没有变色，还是白的。兄台做过这个菌株与载体一起的表达么？

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3楼2013-12-23 08:14:08
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kinshi

铜虫 (小有名气)
做酵母表达的人不少啊，咋没啥人回复呢！？刚镜检了下，划板与摇菌后菌落形态一致，转化后的单克隆融不了，吸打会付诸堵住移液枪，镜检未发现类似细胞。转化过程我与实验室同学各操作了一次，结果一样

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4楼2013-12-23 12:10:05
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kinshi

铜虫 (小有名气)
愿把所有金币赠给能解决我这问题的人！刚把转化后的单克隆挑到100微升水里，强烈涡悬后也只溶解了少部分菌，然后菌液镜检，视野下能看到一些球状，但很多是根须状，有时间换台显微镜拍照上传过来

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5楼2013-12-23 22:23:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 00:20:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-23 08:14:08
多谢回复！以为是原生菌染菌，重新划板了，转化后开始长出来很小1mm左右的菌表面是光滑的，但是长更大表面就不光滑了。至于表达，主要要筛到多拷贝后再做吧？酵母没有变色，还是白的。兄台做过这个菌株与载体一起的 ...

我做的是GS115，其实都一样，只不过smd1168是个蛋白酶缺陷菌株。我载体用的Zα，是胞外分泌性的。而你的载体是胞内表达的~~
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6楼2013-12-23 23:40:07
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:23:24
引用回帖:
4楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-23 12:10:05
做酵母表达的人不少啊，咋没啥人回复呢！？刚镜检了下，划板与摇菌后菌落形态一致，转化后的单克隆融不了，吸打会付诸堵住移液枪，镜检未发现类似细胞。转化过程我与实验室同学各操作了一次，结果一样
...

1.我转化出来的酵母和你的原菌的形态一致，你转化是用什么方法，化学法？电转化？原生质体？
2.你用G418筛选的时候抗生素浓度加到多大的？刚才听你说还没有进行多拷贝筛选，估计你的抗性筛选是从最低浓度开始的。如果你是用电转化法转化的，建议你提高抗生素浓度进行筛选，对抑制杂菌会有点作用，空板总比染了杂菌做一轮什么都没有强。。。~~
3.我对SMD1168不太熟悉，你线性化的是哪个位点？如果在HIS4内部的话，其实可以多一步筛选，我记得smd1168是个HIS+吧（我不确定，你看看3.5K的说明书。。。）
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7楼2013-12-24 00:06:15
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 00:06:15
1.我转化出来的酵母和你的原菌的形态一致，你转化是用什么方法，化学法？电转化？原生质体？
2.你用G418筛选的时候抗生素浓度加到多大的？刚才听你说还没有进行多拷贝筛选，估计你的抗性筛选是从最低浓度开始的。 ...

这是我另一个号
1. 转化用的GenMed的酵母转化试剂盒
2.转化效率涂原液也很低，因为菌落形态不对劲，还没开始筛选，请问你是把MD板上的菌落全部洗下来稀释涂板还是怎么筛选的？
3. 用的Sac I线性化的“For insertion at AOX1 in GS115 or KM71, linearize with Sac I (generates His+
Mut+ in GS115 and His+ MutS in KM71) ”，SMD1168应该与GS115很像，多谢回帖
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
9楼2013-12-24 11:33:26
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 00:13:34
你是用多少倍来看的？？如果有根须状那肯定不是酵母，酵母一般是球状或者椭圆状，如果你用100倍镜的话可能还能看到还在进行出芽生殖的酵母。~不会出现什么根须状的情况。
从你上面提到的菌落形态来看，染菌发生在 ...

没有用油镜，只用了40倍，做了2个对照（单克隆，挑单克隆摇菌后），对照都是球状的，实在搞不懂是哪里会染菌，之前用未线性化质粒转化的菌长出来的克隆都很正常
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
10楼2013-12-24 11:37:13
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