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cuicchao

金虫 (正式写手)

[交流] 毕赤酵母转化后遗传霉素筛选问题

大家好，这次做了一次酵母的点转化实验，GS115菌株，ppic9k质粒，先在MD平板上长起来之后，方法一：用牙签挑上几十个单克隆转移到0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上进行第一个浓度的初筛，3天了，还没东西，着急啊！！！方法二：用无菌水把MD平板上的菌落洗下来，然后涂在0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上，这里我想问一下涂G418平板时菌浓度是不是要特别注意，遗传霉素对细胞密度很敏感？？？？？
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1楼 2013-05-01 13:03:20
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HTGe

金虫 (小有名气)
★ ★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
cuicchao(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:28:28
补充一下，其实第二种洗平板的方法也是有其优势的，挑单克隆毕竟不能将所有高拷贝转化子一网打尽，这是挑单克隆的弊端，往往很可能你会错过那些最高拷贝的克隆，而洗脱后涂布，只要你G418梯度设置合理、宽泛，就一定能筛到最高拷贝的克隆，我们实验室就是这么做的。第一种方法当然会比较纯，这个确实是一个优势；但，绝大部分用毕赤酵母表达系统的实验都是为了得到高拷贝，这是最终极的目标；不过，如果楼主有足够的耐心与时间，还有足够的G418，完全可以把所有克隆都挑出来，但这个确实很费时费力。两种方法各有优缺点，不能一概而论，更不能执其一端，要依实际情况灵活选择应用。
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9楼2013-05-04 11:51:25
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heroxuning

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cuicchao at 2013-05-02 11:23:09
恩，对啊！这几天还想这两种方法的优缺点，我明白了！另外你说说高拷贝的克隆在相对低浓度的G418平板上长得是相比低拷贝的克隆长得快一点吧！...

理论上是这样的，但是你是很难控制好挑的克隆大小很一致，生长起点会不一样
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7楼2013-05-02 14:23:47
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heroxuning

木虫 (正式写手)
★ ★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-02 12:04:15
可以尝试不同浓度的G418平板，0.25mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,我们实验室都做到2.0,3.0mg/L,高抗的一般长的是比较慢，可以第四天查看一下。另外建议挑转化平板克隆，不建议涂菌液，因为严格意义上讲涂菌液长出来的克隆同一克隆几率会比较大，就是说一个转化平板上的高拷贝克隆可以在G418长出N个克隆，筛选就失去了意义
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5楼2013-05-02 11:05:17
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by heroxuning at 2013-05-02 11:05:17
可以尝试不同浓度的G418平板，0.25mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,我们实验室都做到2.0,3.0mg/L,高抗的一般长的是比较慢，可以第四天查看一下。另外建议挑转化平板克隆，不建议涂菌液，因为严格意义上讲涂菌液长出来的克隆同 ...

恩，对啊！这几天还想这两种方法的优缺点，我明白了！另外你说说高拷贝的克隆在相对低浓度的G418平板上长得是相比低拷贝的克隆长得快一点吧！
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6楼2013-05-02 11:23:09
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by HTGe at 2013-05-04 11:51:25
补充一下，其实第二种洗平板的方法也是有其优势的，挑单克隆毕竟不能将所有高拷贝转化子一网打尽，这是挑单克隆的弊端，往往很可能你会错过那些最高拷贝的克隆，而洗脱后涂布，只要你G418梯度设置合理、宽泛，就一定 ...

恩，也是的，我都挑了几百个了，不相信我的运气这么差啊，呵呵
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10楼2013-05-04 12:09:01
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qiuqiushine

新虫 (初入文坛)
★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
你好，想请教你怎么做菌落PCR？我的重组0K质粒转入GS115后，在MD上能够长出单菌落，要做菌落PCR验证，应该怎么做呢？因为是初次做这个实验，实验室也没有人做过，所以不知道怎么做，谢谢
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11楼2013-12-16 16:13:05
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by qiuqiushine at 2013-12-16 16:13:05
你好，想请教你怎么做菌落PCR？我的重组0K质粒转入GS115后，在MD上能够长出单菌落，要做菌落PCR验证，应该怎么做呢？因为是初次做这个实验，实验室也没有人做过，所以不知道怎么做，谢谢

AOX1引物和目的基因引物做PCR，mut+会出现两条带，muts只是一条带，若用阿尔法FActor和目的基因引物做只会出项一条带，这次我想在MD和MM平板上看看长势在判断一下
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12楼2013-12-19 09:49:41
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weiyasong2楼
2013-05-01 13:21   回复  
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
gzl99013楼
2013-05-01 13:26   回复  
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
祝福祝福祝福祝福祝福祝福！
yingying15884楼
2013-05-01 22:28   回复  
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
haixiawu8楼
2013-05-03 00:04   回复  
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
梦想天行13楼
2016-11-12 14:57   回复  
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
， 发自小木虫Android客户端
梦想天行14楼
2016-11-12 14:57   回复  
梦想天行15楼
2017-01-21 11:33   回复  
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