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毕赤酵母转化后遗传霉素筛选问题
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| 大家好，这次做了一次酵母的点转化实验，GS115菌株，ppic9k质粒，先在MD平板上长起来之后，方法一：用牙签挑上几十个单克隆转移到0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上进行第一个浓度的初筛，3天了，还没东西，着急啊！！！方法二：用无菌水把MD平板上的菌落洗下来，然后涂在0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上，这里我想问一下涂G418平板时菌浓度是不是要特别注意，遗传霉素对细胞密度很敏感？？？？？ |
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 分子生化实验经验积累 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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★ ★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
cuicchao(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:28:28
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
cuicchao(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:28:28
| 补充一下，其实第二种洗平板的方法也是有其优势的，挑单克隆毕竟不能将所有高拷贝转化子一网打尽，这是挑单克隆的弊端，往往很可能你会错过那些最高拷贝的克隆，而洗脱后涂布，只要你G418梯度设置合理、宽泛，就一定能筛到最高拷贝的克隆，我们实验室就是这么做的。第一种方法当然会比较纯，这个确实是一个优势；但，绝大部分用毕赤酵母表达系统的实验都是为了得到高拷贝，这是最终极的目标；不过，如果楼主有足够的耐心与时间，还有足够的G418，完全可以把所有克隆都挑出来，但这个确实很费时费力。两种方法各有优缺点，不能一概而论，更不能执其一端，要依实际情况灵活选择应用。 |
9楼2013-05-04 11:51:25
5楼2013-05-02 11:05:17
6楼2013-05-02 11:23:09
7楼2013-05-02 14:23:47
简单回复
gzl99013楼
2013-05-01 13:26
回复
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
祝福祝福祝福祝福祝福祝福！
梦想天行13楼
2016-11-12 14:57
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cuicchao(金币+1): 谢谢参与
， 发自小木虫Android客户端
梦想天行14楼
2016-11-12 14:57
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