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cuicchao

金虫 (正式写手)

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[交流] 毕赤酵母转化后遗传霉素筛选问题

大家好，这次做了一次酵母的点转化实验，GS115菌株，ppic9k质粒，先在MD平板上长起来之后，方法一：用牙签挑上几十个单克隆转移到0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上进行第一个浓度的初筛，3天了，还没东西，着急啊！！！方法二：用无菌水把MD平板上的菌落洗下来，然后涂在0.5mg/ml的遗传霉素G418平板上，这里我想问一下涂G418平板时菌浓度是不是要特别注意，遗传霉素对细胞密度很敏感？？？？？

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1楼 2013-05-01 13:03:20

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HTGe

金虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
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虫号: 2269996

★ ★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
cuicchao(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:28:28

补充一下，其实第二种洗平板的方法也是有其优势的，挑单克隆毕竟不能将所有高拷贝转化子一网打尽，这是挑单克隆的弊端，往往很可能你会错过那些最高拷贝的克隆，而洗脱后涂布，只要你G418梯度设置合理、宽泛，就一定能筛到最高拷贝的克隆，我们实验室就是这么做的。第一种方法当然会比较纯，这个确实是一个优势；但，绝大部分用毕赤酵母表达系统的实验都是为了得到高拷贝，这是最终极的目标；不过，如果楼主有足够的耐心与时间，还有足够的G418，完全可以把所有克隆都挑出来，但这个确实很费时费力。两种方法各有优缺点，不能一概而论，更不能执其一端，要依实际情况灵活选择应用。

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9楼2013-05-04 11:51:25

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heroxuning

木虫 (正式写手)

应助: 5 (幼儿园)
金币: 1798.3
帖子: 391
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虫号: 872465

★ ★
cuicchao(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-02 12:04:15

可以尝试不同浓度的G418平板，0.25mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,我们实验室都做到2.0,3.0mg/L,高抗的一般长的是比较慢，可以第四天查看一下。另外建议挑转化平板克隆，不建议涂菌液，因为严格意义上讲涂菌液长出来的克隆同一克隆几率会比较大，就是说一个转化平板上的高拷贝克隆可以在G418长出N个克隆，筛选就失去了意义

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5楼2013-05-02 11:05:17

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cuicchao

金虫 (正式写手)

应助: 3 (幼儿园)
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在线: 490.2小时
虫号: 1572195

引用回帖:

5楼: Originally posted by heroxuning at 2013-05-02 11:05:17
可以尝试不同浓度的G418平板，0.25mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,我们实验室都做到2.0,3.0mg/L,高抗的一般长的是比较慢，可以第四天查看一下。另外建议挑转化平板克隆，不建议涂菌液，因为严格意义上讲涂菌液长出来的克隆同 ...

恩，对啊！这几天还想这两种方法的优缺点，我明白了！另外你说说高拷贝的克隆在相对低浓度的G418平板上长得是相比低拷贝的克隆长得快一点吧！

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6楼2013-05-02 11:23:09

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