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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » smd1168毕赤酵母转化问题
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by hxswdl at 2013-12-24 11:37:13
没有用油镜，只用了40倍，做了2个对照（单克隆，挑单克隆摇菌后），对照都是球状的，实在搞不懂是哪里会染菌，之前用未线性化质粒转化的菌长出来的克隆都很正常...

其实不线性化，直接转酵母一样能够整合到基因组上只不过转化效率会低一些，而且整合的位点有些不确定~，其实你没有线性化的那一批可以用抗生素浓度梯度筛选一批~~
    你转化用的那个试剂盒我没用过，不太清楚流程。。。还有就是你线性化后又经过什么处理吗？
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11楼2013-12-24 12:27:50
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
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11楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 12:27:50
其实不线性化，直接转酵母一样能够整合到基因组上只不过转化效率会低一些，而且整合的位点有些不确定~，其实你没有线性化的那一批可以用抗生素浓度梯度筛选一批~~
    你转化用的那个试剂盒我没用过，不太清楚流程 ...

线性化后检测条带单一就直接纯化试剂盒纯化的，也没有65℃失活，之前未线性化的一批是直接把MD板上的单克隆点到含G418的平板上筛选的，0.5mg/L 与2mg/L长出来的情况一样
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
12楼2013-12-24 12:35:14
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by hxswdl at 2013-12-24 11:33:26
这是我另一个号
1. 转化用的GenMed的酵母转化试剂盒
2.转化效率涂原液也很低，因为菌落形态不对劲，还没开始筛选，请问你是把MD板上的菌落全部洗下来稀释涂板还是怎么筛选的？
3. 用的Sac I线性化的“For inser ...

1.没用过转化试剂盒~~但是刚才看了看这个试剂盒的说明书，看里面有个Reagent A培养液~估计里面的成分是一些营养物。你可以从加了A培养液培养后的菌液里吸出来一点划个线来判断下是不是试剂盒里的营养液染菌了~下面的清洗液和感化液同上都取出来一点菌液划个线~
2.线性化质粒后有没有经过纯化一类的额外处理？？
3.你转化后涂布的是什么平板？是MD吗？如果是MD的话就不太对了，因为我记得SMD1168好像是个HIS4+菌株（你自己一定要确认一下），如果这个菌株本身就是个HIS+的话你用MD去筛选完全就没意义了..可以直接用G418抗性平板筛选了
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13楼2013-12-24 13:26:32
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by hxswdl at 2013-12-24 12:35:14
线性化后检测条带单一就直接纯化试剂盒纯化的，也没有65℃失活，之前未线性化的一批是直接把MD板上的单克隆点到含G418的平板上筛选的，0.5mg/L 与2mg/L长出来的情况一样...

单位是mg/ml还是mg/L？如果是mg/ml的话其实这一批就可以诱导了
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14楼2013-12-24 13:35:44
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kinshi

铜虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 13:35:44
单位是mg/ml还是mg/L？如果是mg/ml的话其实这一批就可以诱导了...

mg/ml，打错了。smd1168是组氨酸缺陷的，刚买的时候做过验证，单缺组氨酸长不了。参考的一篇博士论文，不过作者的载体上有yfp标记，筛选多拷贝这一步很粗略。用各溶液划板是个好方法，多谢指点！

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15楼2013-12-24 15:41:00
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kinshi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 13:26:32
1.没用过转化试剂盒~~但是刚才看了看这个试剂盒的说明书，看里面有个Reagent A培养液~估计里面的成分是一些营养物。你可以从加了A培养液培养后的菌液里吸出来一点划个线来判断下是不是试剂盒里的营养液染菌了~下面 ...

也不指望其他人能给满意答复了，能把你的转化步骤分享一份我不？悬赏金币全给你了

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16楼2013-12-24 15:44:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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16楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-24 15:44:10
也不指望其他人能给满意答复了，能把你的转化步骤分享一份我不？悬赏金币全给你了
...

我的是电转化做的，你要做吗？？
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17楼2013-12-24 21:49:37
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-24 15:44:10
也不指望其他人能给满意答复了，能把你的转化步骤分享一份我不？悬赏金币全给你了
...

我的是电转化做的，你要做吗？？
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kinshi
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18楼2013-12-24 21:50:07
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kinshi

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18楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 21:50:07
我的是电转化做的，你要做吗？？...

昨天把平板打开闻了下气味，很浓的酒香味，隔壁实验室经常做酵母的同学说是酵母，问了下试剂盒的技术支持，说最好用电转，如果你方便的话可否发一份你的体系我参考下，金币先都给你了。

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19楼2013-12-26 07:57:26
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by kinshi at 2013-12-26 07:57:26
昨天把平板打开闻了下气味，很浓的酒香味，隔壁实验室经常做酵母的同学说是酵母，问了下试剂盒的技术支持，说最好用电转，如果你方便的话可否发一份你的体系我参考下，金币先都给你了。
...

好吧，你把你的邮箱给我，我有空了给你发一份，网上也有很多关于电转的，和那些大同小异
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20楼2013-12-26 14:45:46
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