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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » smd1168毕赤酵母转化问题
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kinshi

铜虫 (小有名气)

[求助] smd1168毕赤酵母转化问题

划板挑单克隆菌落表面光滑，之前转化未线性化的pPIC3.5k后长出来的单克隆也是表面光滑的，后来发现质粒要线性化，结果转入线性化质粒后菌落菌落形态就变了，表面有菌丝状东西，有点像霉菌，但是是有酒香味的，难道转化进质粒后酵母形态发生变化了么？大家有没遇到过，重复2次都这个结果，万分焦急！！！

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1楼 2013-12-22 22:57:27
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-24 12:27:50
其实不线性化，直接转酵母一样能够整合到基因组上只不过转化效率会低一些，而且整合的位点有些不确定~，其实你没有线性化的那一批可以用抗生素浓度梯度筛选一批~~
    你转化用的那个试剂盒我没用过，不太清楚流程 ...

线性化后检测条带单一就直接纯化试剂盒纯化的，也没有65℃失活，之前未线性化的一批是直接把MD板上的单克隆点到含G418的平板上筛选的，0.5mg/L 与2mg/L长出来的情况一样
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
12楼2013-12-24 12:35:14
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-12-23 08:56:14
kinshi: 金币+10, ★有帮助 2013-12-24 11:42:14
kinshi: 金币+110, ★★★很有帮助, 谢谢你的热情帮助！ 2013-12-26 07:58:34
额，如果有菌丝了那肯定是染菌了啊，酵母的颜色改变没？赶紧去做一个镜检。丝状真菌和酵母菌肯定不一样的~，
如果你做几次都是这个样子的话,可能的原因有：
1.你的出发菌株可能已经染菌了。
2.你转化过程中染的杂菌。如果是电转化最有可能出问题的就是电转化杯，如果实在处理不好就换个试试
3.你的抗性筛选可能有问题。

其实你可以做一个菌落PCR验证一下。如果PCR验证了就直接诱导一次。管他什么形状，关键还是要出蛋白，出活性，如果不出蛋白，没有活性再考虑菌落形态的事情，因为要论证是你的线性化质粒导致菌落形态的改变是一件非常困难的事情。
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大家相互帮助哈
2楼2013-12-23 00:48:42
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kinshi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-23 00:48:42
额，如果有菌丝了那肯定是染菌了啊，酵母的颜色改变没？赶紧去做一个镜检。丝状真菌和酵母菌肯定不一样的~，
如果你做几次都是这个样子的话,可能的原因有：
1.你的出发菌株可能已经染菌了。
2.你转化过程中染的杂 ...

多谢回复！以为是原生菌染菌，重新划板了，转化后开始长出来很小1mm左右的菌表面是光滑的，但是长更大表面就不光滑了。至于表达，主要要筛到多拷贝后再做吧？酵母没有变色，还是白的。兄台做过这个菌株与载体一起的表达么？

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3楼2013-12-23 08:14:08
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kinshi

铜虫 (小有名气)
做酵母表达的人不少啊，咋没啥人回复呢！？刚镜检了下，划板与摇菌后菌落形态一致，转化后的单克隆融不了，吸打会付诸堵住移液枪，镜检未发现类似细胞。转化过程我与实验室同学各操作了一次，结果一样

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4楼2013-12-23 12:10:05
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