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小星丹925

木虫 (著名写手)

[交流] PCR优化问题 求助

这是我做148bp 的IL-2 梯度PCR图，首先我设计的引物具体信息是 S: 5'  TGGCTGTATTTCGGTAGCAATG  3'  
A: 5'  TGGTGTGTAGAGCTCGAGATGAA  3'      GT%,TM 值如图

体系为95度3min； 94度30s，退火梯度30s，72度30s 35个循环，72度5min
梯度pcr温度从左到右分别为 64, 63.3 ,59.6 ,56.7 .54.4，52.8
结果很奇怪，自己片段一个都没有出，出的片段比目的基因大，而且还有很多二聚体，求高人指点，问题出在哪呢？根据结果分析 引物，cDNA，pcr体系和退火温度的设定哪个设的不对么？请大家多给点意见，谢谢
还有哦，大家可以看下我的内参基因就跑出来了如图3，还挺亮的，不知道是不是能排除cDNA的问题呢？
PCR优化问题 求助
图片2.png


PCR优化问题 求助-1
IMG_1650.JPG


PCR优化问题 求助-2
IMG_1651.JPG
PCR优化问题 求助-3
图3 右边的pcr条带是B-actin内参.JPG



[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-5 at 10:19 ]
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1楼 2013-12-03 13:16:43
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yuxiangdan

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-03 20:26:43
小星丹925: 金币+2 2013-12-05 10:20:01
不知道你那引物设计的位置可不可以改，至少可以看出你这引物设计的不合理，再看看引物设计的原则吧！换个位置设计吧

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2楼2013-12-03 16:49:37
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuxiangdan at 2013-12-03 16:49:37
不知道你那引物设计的位置可不可以改，至少可以看出你这引物设计的不合理，再看看引物设计的原则吧！换个位置设计吧

怎么看出来的位置不合理呢？能详细说一下么？谢谢
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3楼2013-12-03 17:43:49
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yuxiangdan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-03 17:43:49
怎么看出来的位置不合理呢？能详细说一下么？谢谢...

那引物设计软件有那么多found

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2013-12-03 18:31:37
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grape_vine

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-12-04 02:08:33
小星丹925: 金币+5, 谢谢 2013-12-04 21:26:51
你确信你这个扩增出来应该是148bp吗? 如果是基因组上扩增,应该是多大呢?
我感觉引物设计没有问题啊! 而且跑胶的时候问什么都是中间那个扩增不出来呢?这两个温度也不连续阿!
建议你检查一下看看,
1 是不是cDNA里面有基因组污染?
2 是不是cDNA有问题?
3 有没有可能是某条引物的单引物扩增?
能想到的暂时就这么多了!
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5楼2013-12-03 21:04:55
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
148bp那么短，直接全基因合成，500块钱搞定。
两头想加什么加什么。
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6楼2013-12-04 16:28:50
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huahu3600 at 2013-12-04 16:28:50
148bp那么短，直接全基因合成，500块钱搞定。
两头想加什么加什么。

啊？我是想做荧光定量，片段最好在150bp左右~~~
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7楼2013-12-04 21:25:49
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by grape_vine at 2013-12-03 21:04:55
你确信你这个扩增出来应该是148bp吗? 如果是基因组上扩增,应该是多大呢?
我感觉引物设计没有问题啊! 而且跑胶的时候问什么都是中间那个扩增不出来呢?这两个温度也不连续阿!
建议你检查一下看看,
1 是不是cDNA里面 ...

这个引物扩增的条带是很有意思，两边有条带还都是250bp左右的，我设计的是148的 真不知道为什么？ 这是我新做的 左边的这个引物是我师姐设计的跟我之前做的的就差一俩个基因，其他都相似。也是p出来的都在250
PCR优化问题 求助-4
L-IL-2（师姐设计）R-IL-4.JPG



[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-4 at 21:33 ]
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8楼2013-12-04 21:28:14
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grape_vine

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-04 21:28:14
这个引物扩增的条带是很有意思，两边有条带还都是250bp左右的，我设计的是148的 真不知道为什么？ 这是我新做的 左边的这个引物是我师姐设计的跟我之前做的的就差一俩个基因，其他都相似。也是p出来的都在250 ...

我建议p出来的测个序,就真相大白了!
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9楼2013-12-04 22:33:04
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jinwei331

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
…………………………
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10楼2013-12-04 23:08:32
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by grape_vine at 2013-12-04 22:33:04
我建议p出来的测个序,就真相大白了!...

哦 好的，谢谢，我感觉我是不是应该换个引物试试了
是不是引物的问题的几率比较大
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11楼2013-12-05 08:55:13
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+5 2013-12-05 10:11:52
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:02:17
第一，引物 3端应该要避免是A吧。A的错配率会高很多
第二，你产物只有140bp ,所以extend30S 过长了，降到10s，终extend 15s，循环降为30个
第三，你可以看看你的引物和模板量的比例，试试把引物的量降一点，看看效果如何
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12楼2013-12-05 08:58:41
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-12-05 08:58:41
第一，引物 3端应该要避免是A吧。A的错配率会高很多
第二，你产物只有140bp ,所以extend30S 过长了，降到10s，终extend 15s，循环降为30个
第三，你可以看看你的引物和模板量的比例，试试把引物的量降一点，看看 ...

首先谢谢你的帮助，我会参考你的意见，再设计个引物，或试试降低引物量，对于扩增体系的问题，那其他时间呢？变性 预变性，退火时间都多少比较好呢？
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13楼2013-12-05 10:15:54
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的引物二聚体的Delta G值超过4.5吗？下游引物的3‘端跟上游引物有三个碱基配对，Delta G值为4.5，可能会使引物的扩增效率下降。
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14楼2013-12-05 11:08:23
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-05 10:15:54
首先谢谢你的帮助，我会参考你的意见，再设计个引物，或试试降低引物量，对于扩增体系的问题，那其他时间呢？变性 预变性，退火时间都多少比较好呢？...

变性和退火没有关系 ，按照正常的说明书就可以了。
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15楼2013-12-05 16:00:50
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anning529

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
16楼2013-12-05 16:17:50
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by anning529 at 2013-12-05 16:17:50
RT-PCR最好长度为300，太短了容易P到别的地方。

啊~~这样啊，我之前看说150bp左右比较好，所以才特意设计的~~悲剧了
哦 对了 我要做的是染料法的荧光定量，你说的300是SYBR Green染料法么？

[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-6 at 14:01 ]
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17楼2013-12-06 13:49:41
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-12-05 16:00:50
变性和退火没有关系 ，按照正常的说明书就可以了。...

时间长短没关系么？像这种150bp左右的片段，我看什么时间的都有，有变性退火延伸1min的，有30s的，还有你建议的10s，有些摸不到头脑了
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18楼2013-12-06 13:52:38
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by vege的桌子 at 2013-12-05 11:08:23
你的引物二聚体的Delta G值超过4.5吗？下游引物的3‘端跟上游引物有三个碱基配对，Delta G值为4.5，可能会使引物的扩增效率下降。

哦哦，谢谢
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19楼2013-12-06 13:54:11
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by vege的桌子 at 2013-12-05 11:08:23
你的引物二聚体的Delta G值超过4.5吗？下游引物的3‘端跟上游引物有三个碱基配对，Delta G值为4.5，可能会使引物的扩增效率下降。

你好 我想请教下，很多资料说二聚体和发夹的△G值小于4.5为佳，这个值是绝对值么？我看我的引物很多都是负值 谢谢帮助
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20楼2013-12-26 11:20:14
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