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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR优化问题 求助
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小星丹925

木虫 (著名写手)

[交流] PCR优化问题 求助

这是我做148bp 的IL-2 梯度PCR图，首先我设计的引物具体信息是 S: 5'  TGGCTGTATTTCGGTAGCAATG  3'  
A: 5'  TGGTGTGTAGAGCTCGAGATGAA  3'      GT%,TM 值如图

体系为95度3min； 94度30s，退火梯度30s，72度30s 35个循环，72度5min
梯度pcr温度从左到右分别为 64, 63.3 ,59.6 ,56.7 .54.4，52.8
结果很奇怪，自己片段一个都没有出，出的片段比目的基因大，而且还有很多二聚体，求高人指点，问题出在哪呢？根据结果分析 引物，cDNA，pcr体系和退火温度的设定哪个设的不对么？请大家多给点意见，谢谢
还有哦，大家可以看下我的内参基因就跑出来了如图3，还挺亮的，不知道是不是能排除cDNA的问题呢？
PCR优化问题 求助
图片2.png


PCR优化问题 求助-1
IMG_1650.JPG


PCR优化问题 求助-2
IMG_1651.JPG
PCR优化问题 求助-3
图3 右边的pcr条带是B-actin内参.JPG



[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-5 at 10:19 ]
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1楼 2013-12-03 13:16:43
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+5 2013-12-05 10:11:52
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:02:17
第一，引物 3端应该要避免是A吧。A的错配率会高很多
第二，你产物只有140bp ,所以extend30S 过长了，降到10s，终extend 15s，循环降为30个
第三，你可以看看你的引物和模板量的比例，试试把引物的量降一点，看看效果如何
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12楼2013-12-05 08:58:41
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yuxiangdan

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-03 20:26:43
小星丹925: 金币+2 2013-12-05 10:20:01
不知道你那引物设计的位置可不可以改，至少可以看出你这引物设计的不合理，再看看引物设计的原则吧！换个位置设计吧

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2楼2013-12-03 16:49:37
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuxiangdan at 2013-12-03 16:49:37
不知道你那引物设计的位置可不可以改，至少可以看出你这引物设计的不合理，再看看引物设计的原则吧！换个位置设计吧

怎么看出来的位置不合理呢？能详细说一下么？谢谢
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3楼2013-12-03 17:43:49
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yuxiangdan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-03 17:43:49
怎么看出来的位置不合理呢？能详细说一下么？谢谢...

那引物设计软件有那么多found

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2013-12-03 18:31:37
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