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小星丹925

木虫 (著名写手)

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[交流] PCR优化问题求助

这是我做148bp 的IL-2 梯度PCR图，首先我设计的引物具体信息是 S: 5' TGGCTGTATTTCGGTAGCAATG 3'
A: 5' TGGTGTGTAGAGCTCGAGATGAA 3' GT%,TM 值如图

体系为95度3min； 94度30s，退火梯度30s，72度30s 35个循环，72度5min
梯度pcr温度从左到右分别为 64, 63.3 ,59.6 ,56.7 .54.4，52.8
结果很奇怪，自己片段一个都没有出，出的片段比目的基因大，而且还有很多二聚体，求高人指点，问题出在哪呢？根据结果分析引物，cDNA，pcr体系和退火温度的设定哪个设的不对么？请大家多给点意见，谢谢
还有哦，大家可以看下我的内参基因就跑出来了如图3，还挺亮的，不知道是不是能排除cDNA的问题呢？

图片2.png

IMG_1650.JPG

IMG_1651.JPG

图3 右边的pcr条带是B-actin内参.JPG

[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-5 at 10:19 ]

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1楼 2013-12-03 13:16:43

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grape_vine

金虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-12-04 02:08:33
小星丹925: 金币+5, 谢谢 2013-12-04 21:26:51

你确信你这个扩增出来应该是148bp吗? 如果是基因组上扩增,应该是多大呢?
我感觉引物设计没有问题啊! 而且跑胶的时候问什么都是中间那个扩增不出来呢?这两个温度也不连续阿!
建议你检查一下看看,
1 是不是cDNA里面有基因组污染?
2 是不是cDNA有问题?
3 有没有可能是某条引物的单引物扩增?
能想到的暂时就这么多了!