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小星丹925

木虫 (著名写手)

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[交流] PCR优化问题求助

这是我做148bp 的IL-2 梯度PCR图，首先我设计的引物具体信息是 S: 5' TGGCTGTATTTCGGTAGCAATG 3'
A: 5' TGGTGTGTAGAGCTCGAGATGAA 3' GT%,TM 值如图

体系为95度3min； 94度30s，退火梯度30s，72度30s 35个循环，72度5min
梯度pcr温度从左到右分别为 64, 63.3 ,59.6 ,56.7 .54.4，52.8
结果很奇怪，自己片段一个都没有出，出的片段比目的基因大，而且还有很多二聚体，求高人指点，问题出在哪呢？根据结果分析引物，cDNA，pcr体系和退火温度的设定哪个设的不对么？请大家多给点意见，谢谢
还有哦，大家可以看下我的内参基因就跑出来了如图3，还挺亮的，不知道是不是能排除cDNA的问题呢？

图片2.png

IMG_1650.JPG

IMG_1651.JPG

图3 右边的pcr条带是B-actin内参.JPG

[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-5 at 10:19 ]

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1楼 2013-12-03 13:16:43

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小星丹925

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引用回帖:

5楼: Originally posted by grape_vine at 2013-12-03 21:04:55
你确信你这个扩增出来应该是148bp吗? 如果是基因组上扩增,应该是多大呢?
我感觉引物设计没有问题啊! 而且跑胶的时候问什么都是中间那个扩增不出来呢?这两个温度也不连续阿!
建议你检查一下看看,
1 是不是cDNA里面 ...

这个引物扩增的条带是很有意思，两边有条带还都是250bp左右的，我设计的是148的真不知道为什么？这是我新做的左边的这个引物是我师姐设计的跟我之前做的的就差一俩个基因，其他都相似。也是p出来的都在250