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hospitals

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR的可重复性 已有4人参与

最近,做实验出现了特别诡异的事件,之前PCR扩增很是顺利,中间出差一周后再换了新溶的引物,就怎么也扩不出来了。
这期间,DNA检测没有问题,浓度在27-30ng/ul之间,260/280值在1.7-1.9之间;稀释了DNA到10倍,50倍,100倍;引物是新的,别人也试过,引物没有问题;PCRmix也是新的,也换过牌子;换过PCR仪;换过操作的人.......
真是百思不得其解啊,望高人指点迷津啊,不甚感激!

此外,我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件,引物都是通用的,结果用到自己的实验上就总是没有结果,实验一再的在重复重复,无望中~~~
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-27 00:42:22
我实验刚刚结束,我也遇到过类似的情况,到最后发现通常都是模板问题~
7楼2013-11-30 11:45:13
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:33
模板是什么,gDNA?如何确定引物没有问题的?
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考,不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。
2楼2013-11-29 14:23:21
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:38
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试
海纳百川止于至善
3楼2013-11-29 15:08:07
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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换模板试一下说不定就行了
借你一生好不好
4楼2013-11-29 19:36:35
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-12-06 14:37:47
最好是全部换新后再做下,不要一次更换一种成份
有问题联系!
5楼2013-11-29 20:27:05
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-12-06 14:37:55
我只能说PCR 很神奇,你的问题,我会考虑重新准备模板,因为这个出问题的可能性最大
6楼2013-11-30 11:12:46
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zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:45
更换模板试试,还有就是DNA保存要使用TE保存,最后在-20℃。一般水溶的DNA,很容易降解,特别是室温保存的水溶DNA,三四天都降解的差不多了。希望对你有所帮助
8楼2013-11-30 14:18:27
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hospitals

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-29 14:23:21
模板是什么,gDNA?如何确定引物没有问题的?
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考,不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。

对,模板是gDNA,先说一下PCR重复的问题就是之前能够成功扩增的,这应该能说明引物没有问题吧。现在同样的条件就是无法扩增,换过高保真酶,也无济于事。一开始考虑了模板降解问题,也重新提过DNA,都不行。
再就是第二个问题,同一个种的样品,有的可以个体能够扩增,而其他却怎么也扩不出来,再就是我用同样的模板扩过另外一个基因片段,都是线粒体上的,正常扩增,这说明模板和PCR药品都没问题的呀,真是头疼死了。
9楼2013-12-01 21:52:37
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hospitals

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 1949stone at 2013-11-29 15:08:07
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试

试过了,也不行不通,之前做了这么多实验,第一次这么有挫败感
10楼2013-12-01 21:55:21
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