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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的可重复性
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hospitals

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR的可重复性 已有4人参与

最近，做实验出现了特别诡异的事件，之前PCR扩增很是顺利，中间出差一周后再换了新溶的引物，就怎么也扩不出来了。
这期间，DNA检测没有问题，浓度在27-30ng/ul之间，260/280值在1.7-1.9之间；稀释了DNA到10倍，50倍，100倍；引物是新的，别人也试过，引物没有问题；PCRmix也是新的，也换过牌子；换过PCR仪；换过操作的人.......
真是百思不得其解啊，望高人指点迷津啊，不甚感激！

此外，我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件，引物都是通用的，结果用到自己的实验上就总是没有结果，实验一再的在重复重复，无望中~~~
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1楼 2013-11-29 09:57:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-27 00:42:22
我实验刚刚结束，我也遇到过类似的情况，到最后发现通常都是模板问题~
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7楼2013-11-30 11:45:13
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:33
模板是什么，gDNA？如何确定引物没有问题的？
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考，不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。
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2楼2013-11-29 14:23:21
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:38
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试
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海纳百川止于至善
3楼2013-11-29 15:08:07
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换模板试一下说不定就行了
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借你一生好不好
4楼2013-11-29 19:36:35
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-06 14:37:47
最好是全部换新后再做下，不要一次更换一种成份
有问题联系！
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5楼2013-11-29 20:27:05
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-06 14:37:55
我只能说PCR 很神奇，你的问题，我会考虑重新准备模板，因为这个出问题的可能性最大
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6楼2013-11-30 11:12:46
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zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:45
更换模板试试，还有就是DNA保存要使用TE保存，最后在-20℃。一般水溶的DNA，很容易降解，特别是室温保存的水溶DNA，三四天都降解的差不多了。希望对你有所帮助
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8楼2013-11-30 14:18:27
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hospitals

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-29 14:23:21
模板是什么，gDNA？如何确定引物没有问题的？
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考，不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。

对，模板是gDNA，先说一下PCR重复的问题就是之前能够成功扩增的，这应该能说明引物没有问题吧。现在同样的条件就是无法扩增，换过高保真酶，也无济于事。一开始考虑了模板降解问题，也重新提过DNA，都不行。
再就是第二个问题，同一个种的样品，有的可以个体能够扩增，而其他却怎么也扩不出来，再就是我用同样的模板扩过另外一个基因片段，都是线粒体上的，正常扩增，这说明模板和PCR药品都没问题的呀，真是头疼死了。
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9楼2013-12-01 21:52:37
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hospitals

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1949stone at 2013-11-29 15:08:07
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试

试过了，也不行不通，之前做了这么多实验，第一次这么有挫败感
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10楼2013-12-01 21:55:21
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