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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的操作应注意什么？
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CS—园艺

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR的操作应注意什么？

做了几次PCR都做不出来，RT—PCR做不出来，当我尝试用DNA做PCR的时候可以做出来了，但之后做DNA PCR由做不出来了，试剂是没有问题的。我整个过程在冰浴上做，会不会是这里出了问题？
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1楼 2013-09-29 09:49:02
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CS—园艺

新虫 (初入文坛)
试剂        剂量
无菌水        39μl
10×buffer        5 μl
dNTP（10mmol/L）        1 μl
引物ALF171697        1 μl
引物ALF171698        1 μl
CDNA        2 μl
B Taq酶（含Mg2+）        1 μl
总和
50 μl
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3楼2013-09-29 10:06:12
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feilinshiji

银虫 (小有名气)
★ ★
CS—园艺(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 19:51:15
亲，影响PCR的因素太多了，比如引物的设计、模板的提取、反应条件的设置等等，你说的太笼统了，没法确定究竟是哪儿出了问题
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4楼2013-09-29 10:49:03
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北极胖熊

新虫 (小有名气)
★ ★
CS—园艺(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:24:34
cDNA电泳一下看是否有东西,试剂没问题,引物没问题肯定就是模板有问题
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6楼2013-09-29 15:20:01
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yinerde

铜虫 (小有名气)
★ ★
CS—园艺(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:24:41
个人觉得是不是dNTP加的有点少呢，我们实验室25ul体系加4uldNTP（Takara公司现成试剂，忘了浓度是多少了）
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7楼2013-09-29 16:37:25
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:24:46
做RT—PCR做不出来，用DNA做PCR的时候可以做出来了，说明极可能你反转录有问题，即cDNA模版有问题，但之后做DNA PCR也做不出来了，若试剂是没有问题，试剂没有加错，反应条件各个方面都行，那么说明可能你的引物或模版出问题了
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8楼2013-09-29 16:40:55
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zhghlj

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
注意设置对照呀~
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9楼2013-09-30 10:09:02
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求不重复2楼
2013-09-29 09:53   回复  
CS—园艺(金币+1): 谢谢参与
缩++影: 金币-1, 专业版块请认真回答问题，谢绝灌水，谢谢合作！ 2013-09-29 10:11:18
yingying15885楼
2013-09-29 11:13   回复  
CS—园艺(金币+1): 谢谢参与
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